[发明专利]一种具有穿膜功能的Penetratin-hSOD1及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种具有穿膜功能的Penetratin‑hSOD1及其制备方法与应用，属于分子与细胞生物学领域，制备方法具体为以细胞cDNA为模板，PCR扩增得到Penetratin‑hSOD1片段，将该片段同源重组到pET15b质粒，再将该质粒转化到大肠杆菌BL21中进行诱导表达，破碎菌体后，上清总蛋白通过Ni‑NTA柱纯化，得到高效可溶的Penetratin‑hSOD1。本发明的制备方法得到的Penetratin‑hSOD1可应用于制备抗氧化药物，其加上穿膜肽，可高效穿过细胞膜，与不能穿过细胞膜的SOD1相比，具有更强的细胞抗氧化能力。本发明首次采用穿膜肽Penetratin与SOD1蛋白进行重组，该蛋白与其它类似产品相比，具有更强的细胞穿膜能力和更高的稳定性。

技术领域

本发明属于分子生物学与细胞生物学领域，特别涉及一种具有穿膜功能的重组蛋白Penetratin-hSOD1，还涉及到重组蛋白Penetratin-hSOD1的制备方法，重组蛋白Penetratin-hSOD1在制备抗氧化药物中的应用。

背景技术

超氧化物歧化酶(SODs)是生物体内一类重要的抗氧化酶，可以清除细胞中由于氧化压力产生的多余的活性氧。根据SODs在细胞中的定位可以分为三种(SOD1,SOD2,SOD3)，其中SOD1在细胞中含量最多，分布在细胞质和线粒体中，占总SOD的90％(Zelko,I.N.,T.J.Mariani,and R.J.Folz,Superoxide dismutase multigene family:A comparisonof the CuZn-SOD(SOD1),Mn-SOD(SOD2),and EC-SOD(SOD3)gene structures,evolution,and expression.Free Radical Biology and Medicine,2002.33(3):p.337-349.)。但是SOD1为大分子蛋白，无法有效穿过细胞膜，只能在细胞外发挥作用，进而限制了其药用价值。

以往采用显微注射法，电穿孔法，脂质体法，病毒载体等方法将生物大分子导入细胞内，对细胞毒性大且效率低。穿膜肽(Cell-penetrating peptide，CPP)是由5-30个氨基酸短肽组成的家族，可以将外源性的蛋白质、DNA、siRNA、小分子药物带到细胞中。常见的穿膜肽有HIV-1转录激活蛋白TAT，多聚精氨酸Rn，黑腹果蝇触足肽Penetratin等(Raucher,D.and J.S.Ryu,Cell-penetrating peptides:strategies for anticancertreatment.Trends in Molecular Medicine,2015.21(9):p.560-570.)。

目前报道穿膜性最好的重组SOD1蛋白是TAT-SOD1，但是TAT来源于HIV-1，具有潜在的免疫反应和细胞毒性，且进入细胞内稳定性较差。Penetratin含有丰富的精氨酸和赖氨酸等正电荷氨基酸，能够迅速和带负电的细胞膜结合，可将多种低渗透性货物运送到细胞中，比如胰岛素。(El-Sayed Khafagy et al,Structural requirements of penetratinabsorption enhancement efficiency for insulin delivery,Journal of ControlledRelease,2010,143:302–310)。Penetratin-SOD1与TAT-SOD1相比，具有更强的的穿膜性和稳定性。

SOD1的来源主要有以下几种：一是直接从动物和植物体提取，来源丰富，但是提取和纯化工艺较为复杂。二是利用基因工程重组生产，此方法获得的SOD重组蛋白来源稳定、产量高、周期短、工艺简单、易于纯化、可规模化生产，得到越来越多关注。

发明内容