[发明专利]诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法

权利要求书

1.一种诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述培养液包括：体积比为1:0.9～1.3的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基，以及N2补充剂、B27补充剂、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、GSK-3β抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP信号通路抑制剂、成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子hLIF、肝素和多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子，其中，N2补充剂，B27补充剂，L-抗坏血酸浓度为0.10～1mmol/L；L-谷氨酰胺浓度为1～5mmol/L；所述GSK-3β抑制剂浓度为0.1～0.50μmol/L；所述TGF-β抑制剂浓度为1～5μmol/L；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为0.5～5μmol/L；所述成纤维细胞生长因子的浓度为50～150ng/mL；所述人白血病抑制因子的浓度为10～50ng/mL；所述肝素的浓度为1～10mg/mL；所述多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子和人血清白蛋白；所述脑源性神经营养因子的浓度为10～50ng/mL，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为5～20ng/mL，人血清白蛋白的浓度为1～10mg/mL；

以及，嘌吗啡胺，浓度为1～10μmol/L；激活剂cAMP，浓度为0.5～2mmol/L；抗氧化剂β-巯基乙醇，浓度为5～20μmol/L。

2.如权利要求1所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述GSK-3β抑制剂为TWS119；所述TGF-β抑制剂为RepSox；所述BMP信号通路抑制剂为DMH-1；所述成纤维细胞生长因子为FGF8b。

3.如权利要求1所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基的体积比为1:1，L-抗坏血酸浓度为0.2mmol/L；L-谷氨酰胺浓度为2mmol/L；所述GSK-3β抑制剂浓度为0.2μmol/L；所述TGF-β抑制剂浓度为2μmol/L；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为3μmol/L；所述成纤维细胞生长因子的浓度为100ng/mL；所述人白血病抑制因子的浓度为25ng/mL；所述肝素的浓度为5mg/mL。

4.如权利要求1所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述脑源性神经营养因子的浓度为20ng/mL；神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为10ng/mL；人血清白蛋白的浓度为5mg/mL。

5.如权利要求1所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述培养液还包括：嘌吗啡胺，浓度为5μmol/L；激活剂cAMP，浓度为1mmol/L；抗氧化剂β-巯基乙醇，浓度为10μmol/L。

6.如权利要求1所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述培养液还包括：Rock抑制剂，浓度为0.5～5mmol/L。

7.如权利要求6所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述培养液还包括：Rock抑制剂，浓度为2mmol/L。

8.一种诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤S1，将层粘连蛋白-521的磷酸盐缓冲液和层粘连蛋白-111的磷酸盐缓冲液铺设并包被到细胞培养板上；

步骤S2，将含有诱导多功能干细胞的权利要求1～5任一项所述的培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能祖细胞。