[发明专利]诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法

说明书

本发明公开了一种诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法，包括：体积比为1:0.9～1.3的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基，以及N2补充剂、B27补充剂、L‑抗坏血酸、L‑谷氨酰胺、GSK‑3β抑制剂、TGF‑β抑制剂、BMP抑制剂、成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子hLIF、肝素Heparin和多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子。本发明的培养液可由诱导多功能干细胞为原料定向分化培养得到多巴胺能祖细胞，并可用于直接移植或终末分化为多巴胺能神经元，以及可用于PD的临床细胞替代移植治疗，体外疾病建模研究、药物筛选和其他生物医学应用。本发明具有操作便捷、培养时间短，产量高、分化纯度高，整个环节无动物源性成分等优点。

技术领域

本发明属于干细胞治疗技术领域的干细胞分化技术，具体涉及一种诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种进行性神经退行性疾病，尽管它于200年前就已被发现，但我们对其病因以及潜在的细胞和分子致病机制仍不十分清楚，目前一致认为PD的运动症状主要是由中脑黑质多巴胺能神经元的变性坏死引起的。哺乳动物神经系统损伤后一般不能再生，而传统治疗手段对于神经系统损伤的治疗效果又极为有限，所以多巴胺能神经元就成为细胞替代治疗的理想靶点。

现有患者的材料仅限于生物液体和死后的大脑样本。疾病建模和药物筛选虽然能够在动物模型中开展，但这种方法有自身的局限性，因为实验室动物不会遭受多数神经退行性疾病，包括PD。以已知基因突变的诱导多功能干细胞定向分化获得的神经元为载体，将有助于进一步阐述神经退行性疾病的分子作用机制。这种经干细胞体外诱导分化培养获得的神经细胞可以作为神经退行性疾病病变过程研究的独特模型。

诱导多功能干细胞分化得到的神经元亚型细胞已被证明是药物筛选、神经发育以及神经退行性疾病建模的理想来源；其在应用中面临的一个主要挑战是需要为每个特定的神经元亚型细胞研发相应的分化方法；其进一步应用于临床相关神经退行性疾病的细胞替代治疗中，就更需要分化方案必须以精确可控、有效和可复制的方式产生真正接近原代且具生物活性的神经元亚型细胞，并且批次间的差异达到最小。

当前诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的方法主要分为两种，一种是诱导多功能干细胞先分化为神经干细胞，然后神经干细胞再分化为多巴胺能祖细胞，另一种方法就是诱导多功能干细胞直接分化为多巴胺能祖细胞。前一种方法是用CK1抑制剂和骨形态发生蛋白抑制剂处理诱导多功能干细胞，通过测定经处理诱导多功能干细胞的神经干细胞标志物鉴定神经干细胞，再用至少一种多巴胺能祖细胞诱导化合物处理神经干细胞并且分析最终分化获得的细胞的多巴胺能祖细胞标志物；此方法分化时间长，过程复杂，并且分化效率不高。后一种方法在已报到的文献和专利中均通过在分化过程中以精确的时间顺序添加特定的细胞因子混合物进行定向分化，这些分化方法成本较高，分化时间长，过程复杂。因此针对现有技术的缺点：存在不确定性培养因子(如血清)、诱导周期长、过程复杂且存在不确定性、分化效率差、纯度低等。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效快捷的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液以及分化方法。本发明具有操作便捷、分化培养时间短、分化效率高、产量高、分化纯度高，整个环节无动物源性成分，可用于临床等优点。

本发明的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，包括：体积比为1:0.9～1.3的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基(Neurobasal medium)，以及N2补充剂(N2 supplement CTS厂家：Thermo Fisher货号：A1370701)、B27补充剂(B27 supplementminus vitamin A厂家：Thermo Fisher货号：12587010)、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、GSK-3β抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP信号通路抑制剂、成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子hLIF、肝素(Heparin)和多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子。