[发明专利]基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒，所述的试剂盒包括提取试剂组分、硫化试剂组分和纯化试剂组分；所述的提取试剂组分包括裂解液、提取漂洗液；所述的硫化试剂组分包括转化液、结合液和DNA保护液；所述的纯化试剂组分由洗涤液、磁珠、纯化漂洗液和洗脱缓冲液组成；所述的转化液由重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、四乙基氯化铵和尿素中的一种或多种组成；所述的结合液由胍盐、Tris‑HCl和结合增强剂中的一种或多种组成；所述的DNA保护液由对苯二酚、6‑羟基‑2,5,7,8‑四甲基苯并二氢吡喃‑2‑羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲中的一种或多种组成；其中，所述的结合增强剂为Carrier RNA或特异性的捕获序列中的一种或两种组成。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，进一步来说，涉及表观遗传学基因检测，具体涉及一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒。

背景技术

随着癌症发病率和死亡率的不断增加，肺癌已经成为中国人群死亡的首要原因和主要的公共健康问题。根据国家癌症中心统计，2019年里恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，肺癌是世界上发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。我国75％的肺癌患者在诊断时已属晚期，5年生存率仅为15％～16％。在众多的研究中发现，cfDNA(也称血浆游离DNA或游离DNA)存在于晚期而且甚至存在于早期阶段的癌症患者的血浆/血清和外周血中。继续对其研究，发现cfDNA在疾病早期诊断、预后、检测等领域发挥着重要的作用，尤其在免疫性疾病诊疗、癌症筛查与治疗等方面具有较高价值。而且与组织样本相比，cfDNA检测具有无创和易获得的优势，比如对晚期癌症患者进行基因检测、药效评估等均可用cfDNA进行检测。伴随着cfDNA在临床医疗中的广泛应用，对cfDNA的提取提出了更高的要求。

DNA甲基化是表型修饰的一种，与癌症的发生密切相关。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。如Septin9和(或)SDC2的甲基化与结直肠癌的发生密切相关，SHOX2基因甲基化与肺癌的发生密切相关；EMX1和(或LRRC4)的甲基化与肝癌密切相关。通过检测这些癌症标志物的甲基化水平可实现癌症的无创检测，提高癌症的早期发现率。

目前实际应用中，cfDNA的提取主要还是以手工提取为主，该方法手不仅工作量大，易出错，而且提取转化的最终效果易受人为因素等方面的影响，无法满足现有的检测需求。目前市场上已有不少自动核酸提取平台，如：Roche、Chiron、Abbott以及国内许多公司均开发出了全自动核酸提取仪器，但这些仪器的配套试剂主要为病毒核酸、基因组核酸或其它长片段核酸提取为主，鲜有基于自动化核酸提取平台的cfDNA提取试剂。亚硫酸盐转化试剂如QIAGEN和ZYMO公司的试剂全部以手动操作为主，导致后续的基因检测如qPCR检测均需要设置复孔才能保证检测结果的准确性，而国内如安徽为臻公司和北京博尔诚公司开发的基于自动核酸提取硫化仪器的核酸提取或亚硫酸氢盐纯化试剂，其操作仍不能实现全自动操作，部分试剂需要手工添加，得到的亚硫酸盐纯化DNA浓度低、稳定性差，很难满足下游的基因检测的需求。

因此，急需研发设计一种基于自动化提取硫化一体机的配套检测试剂进而满足后续的表观遗传学(基因)检测需求。

发明内容

针对现有应用中鲜有基于全自动提取硫化一体机的配套cfDNA提取和亚硫酸氢盐纯化试剂的技术瓶颈问题，本发明提供了一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，包括提取试剂组分、硫化试剂组分和纯化试剂组分；

所述的提取试剂组分包括裂解液、提取漂洗液；

所述的硫化试剂组分包括转化液、结合液和DNA保护液；

所述的纯化试剂组分由洗涤液、磁珠、纯化漂洗液和洗脱缓冲液组成。