[发明专利]一种基于共价连接的已知分子与蛋白质相互作用检测系统及其鉴定或验证方法

说明书

本发明公开了一种基于共价连接的已知分子与蛋白质相互作用检测系统及其鉴定或验证方法，所述检测系统包括：a)链霉亲和素‑短肽四聚体；b)PafA酶；c)生物素修饰的已知分子。本发明采用生物素标记已知分子，已知分子与蛋白质发生相互作用后，通过链霉亲和素‑短肽四聚体在温和的条件下高效地捕获已知分子的相互作用蛋白质，再在PafA酶的催化下，将短肽与已知分子的相互作蛋白质共价连接，从而将相互作用的已知分子与蛋白质之间的非共价结合转换为链霉亲和素与蛋白质之间的共价连接，从而进行分析，分离和鉴定。本方法可以在保持已知分子天然结构的基础上，实现弱相互作用和瞬时相互作用的捕获，可以用于已知分子与相互作用蛋白质的验证和发现。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种已知分子与蛋白质相互作用检测系统，尤其涉及一种基于共价连接的已知分子与蛋白质相互作用检测系统及其鉴定或验证方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的执行者。超过80％的蛋白质通过与其他分子相互作用发挥功能，包括胚胎发育、细胞通讯、受体-配体结合、信号传导等广泛的生命过程。无序、失控的蛋白质-分子相互作用可能引发癌症、神经退行性疾病等(kesin et al.,2016.Chem.Rev.,116,4884-4909)。生理过程中小分子或小分子药物与蛋白质的相互作用在生物医学和临床应用中研究广泛，有助于对机体生理代谢过程的进一步理解以及指导药物设计与合成。发现和验证蛋白质与其他分子如蛋白、DNA、RNA、小分子的相互作用，对于在分子层面揭示生命活动的内在规律具有重要意义。蛋白质-分子的相互作用研究一直存在两个难点，一是由于细胞内环境的复杂性，相互作用网络错综复杂，每一种分子存在多种相互作用；二是蛋白质与分子间的相互作用具有强弱和时长的差异，弱相互作用和瞬时相互作用通常难以捕获。

经典的蛋白质-分子相互作用鉴定技术包括免疫沉淀技术、Pull Down、芯片技术等，免疫沉淀法包括蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)、染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)(Das PM et al.,2017.Biotechniques.37(6):961-9.)、RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation)(Gagliardi M et al.Methods Mol Biol.2016；1480:73-86.)、小分子亲和层析(Sleno etal.2008,Curr Opin Chem Biol,12,46-54)(Sato,et al.,2010,Chem Biol,17,616-623)等。ChIP和CLIP可分别用于鉴定DNA和RNA与蛋白质的相互作用，在活细胞状态下利用甲醛等交联固定DNA或RNA与蛋白质的复合物，ChIP可通过抗体富集目标蛋白与DNA复合物，CLIP则可以结合特定RNA并通过质谱鉴定互作蛋白。Co-IP通过抗体富集目标蛋白及其相互作用蛋白质，依赖于蛋白质间的非共价相互作用。Pull down技术如GST Pull Down、RNA pulldown、小分子亲和层析等则通过连接在蛋白、RNA或小分子上的标签富集目标分子从而获得相互作用蛋白。以上两类技术分别用于体内及体外的蛋白质-分子相互作用发现及验证，方法易于重复，操作简单且成本较低，但抗体或亲和介质的非特异性结合容易导致高背景信号，对于弱相互作用和瞬时相互作用难以检测，得到的结果需要使用其他方法来进一步验证(louche et al.,2017.Methods Mol.Biol.,1615,247-255.)。蛋白质芯片(Deng etal.,2014.Cell Rep.,9,2317-2329.)或基因芯片(Hu et al.,2009,Cell,139,610-622)分别将多个蛋白或DNA片段点制在芯片上，以蛋白质芯片为例，将带标签的目标分子(蛋白、DNA、RNA、小分子)与蛋白质芯片共孵育后，洗涤去掉非特异性结合，后续可鉴定分子与芯片上蛋白的相互作用。芯片技术具有通量高，样品用量少，反应时间短等优点，能够在一次实验中全局性地发现与目的分子相互作用的分子，是一种高效的分子/蛋白质相互作用研究工具。但同时该方法也具有一定的局限性，芯片检测到的信号是分子的体外相互作用结果，考虑到生物体内环境的复杂性和多样性，不可避免会存在假阳性，这也是体外筛选方法中普遍存在的问题。