[发明专利]一种大鼠血浆中麝香通心滴丸蟾蜍二烯内酯成分的检测方法及其用途

说明书

本发明提供一种大鼠血浆中麝香通心滴丸蟾蜍二烯内酯成分的检测方法及其用途，具体采用超高效液相色谱‑串联质谱(UPLC‑MS/MS)对大鼠血浆中沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒精、蟾毒灵和酯蟾毒配基进行定性和定量检测，具体步骤为灌胃麝香通心滴丸大鼠血浆加内标物，经甲醇蛋白沉淀；通过UPLC‑MS/MS进行检测。其中蟾毒灵检出限为1.00ng/mL，定量限为3.00ng/mL；沙蟾毒精、远华蟾毒精和酯蟾毒配基检出限为2.00ng/mL，定量限为6.00ng/mL；去乙酰华蟾毒精检出限为3.00ng/mL，定量限为9.00ng/mL。本方法可在15min完成检测，通过MRM色谱图的保留时间、峰面积比值，结合标准曲线完成定量计算，操作更便捷，减少了血浆中内源性物质干扰，可用于麝香通心滴丸的药代动力学研究。

技术领域

本发明涉及一种大鼠血浆内复方中药成分的检测方法及其用途，特别涉及血浆内麝香通心滴丸中蟾蜍二烯内酯成分的检测。

背景技术

麝香通心滴丸是一种传统中药复方，用于冠心病稳定型劳累性心绞痛，中医辨证气虚血瘀证，症见胸痛胸闷，心悸气短，神倦乏力。全方包括蟾酥、人工麝香、丹参、人参茎叶总皂苷、人工牛黄、熊胆粉以及冰片七味药材。研究表明，麝香通心滴丸是通过降低血液中内皮素-1(ET-1)、C反应蛋白(CRP)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)，同时提升血液中一氧化氮含量的方式保护内皮细胞免受动脉粥样硬化损伤。此外，麝香通心滴丸可降低人体内有害酯类，同时改善异常血液流变学指标。

蟾酥作为麝香通心滴丸的君药，主要药效成分为蟾蜍二烯内酯类化合物，具有抗肿瘤、强心、麻醉止痛和抗炎等功效。另外，该类化合物具有一定的毒性，入血含量检测对于药代动力学研究以及合理用药具有重要意义。

当前，麝香通心滴丸等中药复方制剂的化学成分检测主要针对成药。麝香保心丸中包含人工麝香、人参、苏合香、蟾酥、人工牛黄、冰片和肉桂，其中《麝香保心丸质量标准提升研究》(第二军医大学，2018) 采用超高效合相色谱-串联质谱进行分析，采用流动相B(含10、20、30mM醋酸铵的甲醇)和超临界流体洗脱，检测了蟾毒灵、酯蟾毒配基、蟾毒配基在内的28个活性成分。该研究中麝香通心滴丸与麝香保心丸组方有所区别，蟾酥有效成分检出数量有限，且无法定量。《基于PI3KAkt信号转导通路探讨麝香通心滴丸抗心肌缺血的物质基础和作用》(福建中医药大学，2017)采用HPLC-Q-TOF-MS/MS方法进行定性分析，其中液相条件采用乙腈-甲酸水为流动相，检测出了沙蟾毒精、蟾毒灵和酯蟾毒配基，但峰型和分离度不好，无法进行定量。专利CN201911410029.6《一种复方中药特征图谱构建及含量测定方法》(申请日 2019.12.31)采用高效液相色谱法实现同步定量检测麝香通心滴丸中蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基等10个药效成分的定量检测，其中流动相为0.005～0.05％磷酸乙腈(A)与0.005～0.05％磷酸水(B)，柱温29～31℃，检测波长198～206nm，流速为1.28～1.32mL/min。

但麝香通心滴丸入血成分与成药有所区别，主要体现在原药成分被代谢后形成的代谢产物。以蟾酥为例，《Analysis of the bioactive constituents of ChanSu in ratplasma by high performance liquid chromatography with mass spectrometricdetection(高效液相色谱-质谱联用法分析大鼠血浆中蟾酥的生物活性成分)》 (Journalof Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2010,53(3):646-654)中采用高效液相色谱-串联质谱法对照血浆和蟾酥提取物进行化学分析，得到4种代谢产物与20种原药化合物。因代谢产物的结构与原药有相关性，代谢产物对原药成分的检测存在一定影响。而且，复方中药制剂入血后，代谢产物相比单味药材更复杂，检测结果更难判定。