[发明专利]一种评估冠心病预后分子标志物NFIA及其逆转录引物、扩增引物和应用

权利要求书

1.一种评估冠心病预后分子标志物NFIA，其特征在于，为非编码RNA，其转录本长度为140个核苷酸，该核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

2.一种评估冠心病预后分子标志物NFIA的逆转录引物，其特征在于，逆转录引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2所示。

3.一种评估冠心病预后分子标志物NFIA的扩增引物，其特征在于，扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物为序列表中SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

4.如权利要求1所述的评估冠心病预后分子标志物NFIA在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的评估冠心病预后分子标志物NFIA在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括：权利要求2所述的评估冠心病预后分子标志物NFIA的逆转录引物、权利要求3所述特异性扩增引物、内参基因18S表达的特异性扩增引物序列，其上游引物和下游引物序列为序列表中SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、从血浆中提取miRNA以及进行逆转录和荧光定量PCR的试剂。

6.根据权利要求5所述的评估冠心病预后分子标志物NFIA在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括：

(1)从冠心病或健康者中抽提总RNA所用试剂：包括Trizol液20mL、氯仿80mL、异丙醇80mL、抑制RNA降解溶剂40mL、体积分数为75％的乙醇30mL，DEPC水10mL；

(2)以总RNA为模板进行逆转录所用试剂：包括评估冠心病预后分子标志物NFIA的逆转录引物：浓度为10μM，30μL；内参基因18S的下游引物：浓度为10μM，30μL；逆转录反应缓冲液5×RT Buffer 150μL；逆转录酶M-MLV浓度200U/μL，50μL；

(3)将cDNA实时定量PCR：包括NFIA实时荧光定量PCR特异性引物：浓度均为3μM，各25μL；内参基因18S表达的特异性扩增引物：浓度均为3μM，各25μL；实时荧光定量SYBR染料SYBRGreen qPCR Mix 500μL；无RNA酶的水25μL。

7.根据权利要求5所述的评估冠心病预后分子标志物NFIA在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，其特征在于，评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法为：

(1)血浆RNA的抽提；

(2)NFIA RNA的逆转录；

(3)利用NFIA的特异性引物进行实时定量PCR；

(4)NFIA表达量的数据分析：采用相对定量方法2^-△△Ct法。

8.根据权利要求7所述的评估冠心病预后分子标志物NFIA在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，其特征在于，在步骤(1)中：

(1-1)取100μL血浆加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中，充分混合均匀；

(1-2)室温放置5分钟，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡30秒，然后再12000转/分钟离心10分钟；

(1-3)取上层水相于一新的EP管中，加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀；室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟；

(1-4)小心地弃去上清液，加入1mL的体积分数为75％乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟；重复操作一次；

(1-5)弃去上清液，室温或真空干燥5～10分钟；用50μL DEPC水将RNA溶解；

(1-6)RNA浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸1μL RNA样品加至样品孔，根据读数直接确定RNA的浓度。核酸浓度测定仪的测定的OD260/OD280比值，比值在1.8-2.0之间认为RNA纯度很好；最后，RNA贮存于-80℃冰箱备用。