[发明专利]酶切探针恒温检测呼吸道感染细菌病原体的试剂盒

说明书

本发明提供一种酶切探针恒温检测呼吸道感染细菌病原体的试剂盒，将12个病原体靶标各自引物探针组合成四个三重核酸反应液，检测每一个细菌病原体的探针均是含有一个RNA碱基的探针和包括6条恒温扩增引物。利用本发明中提供的核酸检测试剂盒，可实现四个单管多重恒温扩增检测呼吸道感染中的12种频率高发的细菌类病原体，且试剂盒操作简便，可实现床旁检测，整个检测用时在30min以内，能够快速精准地实现待测样本中多种细菌病原的筛查。

技术领域

本发明涉及核酸恒温检测技术领域，特别涉及酶切探针恒温检测呼吸道感染细菌病原体的试剂盒。

背景技术

呼吸道感染疾病在临床上常见高发，细菌感染是引起呼吸道疾病的常见原因，引起呼吸道细菌性感染的致病菌有很多，在成人呼吸道细菌感染中，以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肠球属、肺炎链球菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠杆菌、星形奴卡菌这12种最常见。因此，实现对这12种呼吸道常见细菌病原体实现特异且快速的筛查检测，便于临床医生对病人进行及时地精准诊断，并提供合适的用药治疗方案。

目前临床上检测感染病原体仍以分离培养作为确诊的金标准，但分离培养法存在培养阳性率低，且培养周期长等问题，无法达到快速确诊的目的。现有的经典核酸分子检测技术如荧光定量PCR或者其它各种各样的PCR技术，大多需要大量投入仪器设备和专业的技术人员，也不能满足临床尤其是ICU病人的即时检测需求。而恒温核酸检测技术具有反应时间快、效率高、不需专用的分子生物学仪器设备以及对检测人员要求不高等特点，更适用于现场即时检测。

但目前的核酸恒温扩增方法大多难以进行单管多重检测，或者在进行多重检测时的灵敏度与特异性都难以达到单重时的效果。因此，建立一种核酸恒温多重扩增检测呼吸道感染细菌病原体，对于实现患者的快速精准诊断具有重要指导意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种酶切探针恒温检测呼吸道感染细菌病原体的试剂盒，将12个病原体靶标各自引物探针组合成四个三重核酸反应液，第一个三重核酸反应液包括用于检测金黄色葡萄球菌、检测大肠杆菌和检测星形奴卡菌的引物和探针；第二个三重核酸反应液包括用于检测铜绿假单胞菌、检测肺炎链球菌和检测嗜麦芽窄食假单胞菌的引物和探针；第三个三重核酸反应液包括用于检测鲍曼不动杆菌、检测流感嗜血杆菌和检测肠球属的引物和探针；第四个三重核酸反应液包括用检测肺炎克雷伯杆菌、检测嗜肺军团菌和检测洋葱伯克霍尔德菌的引物和探针；检测每一个细菌病原体的探针均是含有一个RNA碱基的探针和包括6条恒温扩增引物，所述探针荧光报告基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向的左侧，荧光淬灭基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向右侧；每个三重核酸反应液内检测每一个细菌病原体的探针标记不同的荧光基团。

在一种实施方式中，第一个三重核酸反应液包括以下用于检测金黄色葡萄球菌、检测大肠杆菌和检测星形奴卡菌的引物和探针，检测金黄色葡萄球菌的引物是SEQ ID No：1-6，探针是SEQ ID No：7所示；检测大肠杆菌的引物是SEQ ID No：8-13，探针是SEQ ID No：14；和检测星形奴卡菌的引物是SEQ ID No：15-20，探针是SEQ ID No：21，

，其中“SA”代表金黄色葡萄球菌，“Ecoli”代表大肠杆菌，和“NuA”代表星形奴卡菌。

在一种实施方式中，第二个三重核酸反应液包括以下用于检测铜绿假单胞菌、检测肺炎链球菌和检测嗜麦芽窄食假单胞菌的引物和探针，检测铜绿假单胞菌的引物是SEQID No：22-27，探针是SEQ ID No：28所示；检测肺炎链球菌的引物是SEQ ID No：29-34，探针是SEQ ID No：35；和检测嗜麦芽窄食假单胞菌的引物是SEQ ID No：36-41，探针是SEQ IDNo：42，