[发明专利]利用超高分辨成像技术实时追踪活体植物细胞核内蛋白运动的方法

权利要求书

1.利用超高分辨成像技术实时追踪活体植物细胞核内蛋白运动的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)转基因植物材料的获得：利用基因工程手段，将目的基因和荧光报告基因进行融合表达，构建到植物基因组上，筛选得到转基因植株；

2)超分辨成像观察：用超分辨激光共聚焦显微镜对所得的转基因植株样品进行成像观察；

3)拍摄时间序列图像：利用超分辨激光共聚焦显微镜拍摄时间序列图像，捕获和追踪活细胞核内蛋白的动态，以获得高时空的单分子运动信息；

4)图像处理和分析运动参数信息：根据超分辨激光共聚焦显微镜所成像的时间序列图像信息，使用软件对采集的多张序列图像进行分析和处理，并绘制荧光蛋白在植物细胞核内的运动轨迹，并进一步计算出目标蛋白的荧光强度随时间的变化规律，进而得到荧光强度动态分布的动力学参数信息；

其中，所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)包括：通过同源重组方法将目的基因和带有荧光报告基因GFP的真核表达载体进行连接，其中目的基因位于荧光报告基因ATG起始密码子的上游；所得重组表达载体通过农杆菌介导法转化拟南芥，筛选得到转基因植株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的基因为拟南芥MED18基因，所述真核表达载体为pCAMBIA2300-35S-GFP。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述样品为转基因拟南芥的根部样品，优选根尖。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中用ZeissLSM880Airyscan超分辨激光共聚焦显微镜的Airyscan模式进行成像，物镜使用100倍油镜，选取激发波长为488nm，收集波长为500～560nm，对样品进行超分辨成像，并根据拟南芥的样品状态和荧光亮度，来调整激光强度和EMGain电子增益倍数，使成像效果达到最佳。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中利用超分辨激光共聚焦显微镜拍摄的时间序列图像，Frame Size设置为512×512，拍摄速度设置为Max 9倍速，以632ms的时间间隔获取图像。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)中根据超分辨激光共聚焦显微镜所成像的时间序列图像信息，使用Image J软件对采集的多张序列图像进行分析和处理，利用Imaris软件对目标蛋白的运动进行追踪和分析，数据拟合在OriginPro8软件中完成。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4)中将大于3帧的荧光点用于细胞核内荧光蛋白的分析。