[发明专利]利用超高分辨成像技术实时追踪活体植物细胞核内蛋白运动的方法

说明书

本发明提供一种利用超高分辨成像技术实时追踪活体植物细胞核内蛋白运动的方法，包括：1)转基因植物材料的获得；2)超分辨成像观察；3)拍摄时间序列图像；4)图像处理和分析运动参数信息。本发明利用ZeissLSM880Airyscan超分辨激光共聚焦显微镜的Airyscan模式下成像具有超高分辨率的特点，对植物细胞核内蛋白质的精细结构进行超高分辨率成像观察，对活细胞样品的光毒性伤害小，能够在活体状态下、原位观察细胞核蛋白的运动轨迹等动态特征；具有成像速度快、灵敏度高的特点，能够真实地反映植物细胞核内蛋白分子的瞬时运动和长期动态特征，并在单分子水平上对活细胞核蛋白的运动异质性进行单分子追踪和分析。

技术领域

本发明涉及生物成像技术和细胞生物学领域，具体地说，涉及一种利用超高分辨成像技术实时追踪活体植物细胞核内蛋白运动的方法。

背景技术

细胞核是存在于植物细胞中的封闭式膜状胞器，其内部含有细胞中大多数的遗传物质，是细胞内遗传信息的储存、复制和转录的主要场所。植物细胞核内很多转录因子的结构和功能已被广泛研究和报道，然而关于活体植物细胞核内分子的运动轨迹和动态特征目前仍不清晰。近年来，随着活体荧光标记技术和超分辨率成像技术的发展，使得人们可以直接对活体细胞内分子进行超分辨、高时空动态的成像和追踪观察，实现对其运动过程以及动态特征的分析，从而为深入研究其功能机制奠定基础。

超分辨激光共聚焦显微技术是一种将高灵敏度、XY维度上达到超高分辨率，并以快速图像采集速度于一体的新型成像技术。与传统的光学显微镜相比，该超分辨技术能够将分辨率提高近10倍，这就使亚细胞的结构细节得到前所未有的可视化，并且实现了快速活体成像的需求，可以在单分子水平上直接观察到目标分子的动态特征。然而，由于植物样品本身存在细胞壁较厚、叶绿体的自发荧光强和生长形式限制等问题，因此目前关于植物细胞核内单个分子的活体动态研究甚少。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用超高分辨成像技术实时追踪活体植物细胞核内蛋白运动的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种利用超高分辨成像技术实时追踪活体植物细胞核内蛋白运动的方法，包括以下步骤：

1)转基因植物材料(含荧光分子的转基因植物材料)的获得：利用基因工程手段，将目的基因和荧光报告基因进行融合表达，构建到植物基因组上，筛选得到转基因植株；

2)超分辨成像观察：用超分辨激光共聚焦显微镜对所得的转基因植株样品进行成像观察；

3)拍摄时间序列图像：利用超分辨激光共聚焦显微镜拍摄时间序列图像，捕获和追踪活细胞核内蛋白的动态，以获得高时空的单分子运动信息；

4)图像处理和分析运动参数信息：根据超分辨激光共聚焦显微镜所成像的时间序列图像信息，使用软件对采集的多张序列图像进行分析和处理，并绘制荧光蛋白在植物细胞核内的运动轨迹，并进一步计算出目标蛋白的荧光强度随时间的变化规律，进而得到荧光强度动态分布等动力学参数信息。

本发明中，所述植物为拟南芥。

前述的方法，步骤1)包括：通过同源重组方法将目的基因和带有荧光报告基因GFP的真核表达载体进行连接，其中目的基因位于荧光报告基因ATG起始密码子的上游；所得重组表达载体通过农杆菌介导法转化拟南芥，筛选得到转基因植株。

本发明中，可以将GFP替换成其它荧光蛋白。

前述的方法，所述目的基因可以是拟南芥MED18基因(GenBank：AT2G22370)，所述真核表达载体可以是pCAMBIA2300-35S-GFP(图7)。

前述的方法，步骤2)中所述样品为转基因拟南芥的根部样品，优选根尖。