[发明专利]一种微小脲原体的微滴数字PCR检测方法及其试剂盒

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种微滴式数字PCR绝对定量检测微小脲原体方法以及试剂盒。根据微小脲原体4种亚型的基因的一致序列设计第一套引物、探针(标记FAM)，根据人类甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶基因(GAPDH)序列设计第二套引物、探针(标记VIC)。本发明能同时检测微小脲原体4个亚型且与解脲脲原体无交叉反应。本发明利用微滴式数字PCR技术，对标本中的微小脲原体进行绝对定量，该方法灵敏度高、特异性强、无需标准曲线，具有无可比拟的精确性。本发明的方法及试剂盒可用于临床实验室对微小脲原体感染的辅助诊断和抗菌药物使用后治疗效果的监测，具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种体外核酸诊断方法，具体涉及一种微滴式数字PCR绝对定量检测微小脲原体的方法以及试剂盒。

背景技术

解脲脲原体(Ureaplasma spp.)是引起人类泌尿生殖道感染的病原体之一。根据分子生物学特征分为两个生物群和14个血清型，两个生物群包括微小脲原体(Ureaplasmaparvum，Up)和解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)。其中基因组较小的血清型1、3、6、14属于微小脲原体，占脲原体感染的90％～92％；而基因组较大的血清型2、4、5、8～13属于解脲脲原体，只占脲原体感染的8％～10％。

研究表明，解脲脲原体(Ureaplasma spp.)与非淋球菌尿道炎、宫颈炎、多种不良妊娠结局(流产、早产、绒毛膜羊膜炎、胎膜早破等)密切相关。但解脲脲原体(Uu spp.) 的致病性一直有争议。一篇Meta分析表明，Uu与男性不育之间存在显著相关，但Up 与男性不育并无明显相关。但其他临床研究表明Up的感染会加重孕妇早产的风险。此外，有学者认为，解脲脲原体的致病性可能与菌量负荷相关。因此，解脲脲原体准确分型及绝对定量将有助于疾病的临床诊断、治疗和阐明其致病机制。

之前，脲原体主要通过血清学分型，但血清型分型操作繁琐，易出现交叉反应，结果难以准确判断。目前，主要通过基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(qPCR)对解脲脲原体基因分型，如：专利CN201410113941.6和CN103045721A。但qPCR需是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的浓度。不同实验室构建的标准曲线不亦相同，同一标本不同实验室的定量结果往往差异甚大。因此，为了克服现有技术的缺点和不足，本发明提供一种灵敏度更高、精密度更高、不依赖标准曲线进行绝对定量的方法。

作为第三代核酸定量检测手段的微滴式数字PCR系统，Bio-Rad采用了先进的微流体技术，每份样本可生成20,000个高度均一的纳升级微滴，再结合统计学原理，以数字方式获得靶标样本的拷贝数含量，无需依赖外部参照和标准物质，实现更高的检测灵敏度、精密度。

本发明根据微小脲原体parC基因序列建立一种绝对定量检测微小脲原体的微滴式数字PCR反应。

发明内容

本发明的目的是克服实时荧光PCR法的定量不准的缺陷，提供一种微滴式数字PCR检测微小脲原体的方法及其试剂盒。具体设计一种特异性的引物、探针利用微滴式数字PCR绝对定量检测微小脲原体的方法；

本发明的另一目的在于提供一种用于上述方法的试剂盒。

本发明采用通用的DNA提取试剂盒提取微小脲原体的DNA，在对微小脲原体4个亚型序列分析的基础上，设计通用引物能同时扩增微小脲原体4个亚型而不扩增解脲脲原体10个亚型。此外，与其他宫颈炎相关的病原微生物均无交叉扩增，因此具有良好的特异性。

更具体的，本发明的一种微小脲原体的微滴数字PCR检测方法及其试剂盒包括：

1.引物和探针的制备；

根据微小脲原体parC序列，设计并合成如下序列的引物：

Up-F：5’AGCTGTTTATATATGGAACGAACAA3’(1782nt-1806nt)；