[发明专利]一种解脲脲原体的微滴数字PCR检测方法及其试剂盒

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种绝对定量检测解脲脲原体(Ureaplasma Urealyticum，Uu)的方法以及检测试剂盒。根据解脲脲原体10种亚型的ParC基因一致序列设计第一套引物、探针(标记FAM)，根据人类甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶基因(GAPDH)序列设计第二套引物、探针(标记VIC)。本发明能同时检测解脲脲原体10个亚型且与微小脲原体无交叉反应，克服了qPCR核酸检测定量不准确，检测结果存在“灰区”等缺点。本发明的方法及试剂盒具有特异性高、灵敏度高、重复性好、不依赖标准曲线的绝对定量的特点。本发明的方法及试剂盒可用于临床实验室对解脲脲原体感染的辅助诊断和抗菌药物使用后治疗效果的监测，具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种体外核酸诊断方法，具体涉及微滴数字PCR绝对定 量检测解脲脲原体方法以及试剂盒。

背景技术

现有技术公开了解脲脲原体(Urealyticum spp.)根据分子生物学特征分为两个生物群 和14种血清型。其中基因组较大的血清型2、4、5、8～13属于解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)，占脲原体感染的8％～10％；其余血清型1、3、6、14属于微小脲原体 (Ureaplasma parvum，Up)，占脲原体感染的90％～92％。

研究表明，解脲脲原体(Urealyticum spp.)可能与非淋球菌尿道炎、阴道炎、宫颈炎、 多种不良妊娠结局(流产、早产、绒毛膜羊膜炎、胎膜早破等)密切相关。但由于不同实验室 采用的检测方法不同，研究人群各异，目前，对于解脲脲原体的致病性业界仍然存在很大争 议，而且其致病性是否与不同生物型或细菌负荷相关也不明确。

目前，国内不同的实验室建立并公布了基于实时荧光定量PCR(qPCR)检测解脲脲原体 检测方法，如专利CN103045721A公布了解脲脲原体和微小脲原体qPCR检测方法，专利CN201410113941.6公布解脲脲原体14种血清型qPCR检测方法。qPCR分为相对定量和绝对定量。其中，绝对定量是将已知拷贝数的标准品梯度稀释至不同浓度作为模板进行实时PCR反应。通过标准曲线来推算未知样品的拷贝数。但是，不同实验室间建立的标准曲线并不相同，因此同一标本不同实验室qPCR法检测会推算出不同的拷贝数。

微滴式数字PCR(Digital PCR)，是在传统的PCR扩增前对样本进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分配到2万个微滴中，其中每个微滴中含有0个、1个或多个待检核酸靶分子。扩增结束后，对每个微滴的荧光信号进行逐一分析，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得到靶分子的起始拷贝数或浓度。由于把样本稀释成多个微滴，实现了“单分子PCR扩增”。因此，本发明具有特异性高、灵敏度高、无需标准曲线进行绝对定量的特点。

发明内容

本发明的目的是克服实时荧光PCR法的定量不准的缺陷，提供一种解脲脲原体微滴式 数字PCR检测方法及其试剂盒。具体设计一种特异性的引物利用微滴数字PCR绝对定量检 测解脲脲原体的方法；

本发明的另一目的在于提供一种用于上述方法的试剂盒。

本发明采用专门的DNA提取试剂盒提取解脲脲原体的DNA，在对解脲脲原体10个亚型 序列分析的基础上，设计通用引物能同时扩增解脲脲原体10个亚型而不扩增微小脲原体。此 外，与其他宫颈炎相关的病原微生物均无交叉扩增，因此具有良好的特异性。

更具体的，本发明的一种解脲脲原体的微滴数字PCR检测方法及其试剂盒包括：

1.引物和探针的制备；

根据解脲脲原体parC序列，设计并合成如下序列的引物：

Uu-F：5’ATTATCAAAACGTGCAATGA 3’(nt2187-nt2206)；

Uu-R：5’ACCAACTAAAAATGCTGCTAAA 3’(nt2250-nt2271)；