[发明专利]用于鉴定谷斑皮蠹的LAMP引物组及其应用

说明书

本发明公开了用于鉴定谷斑皮蠹的LAMP引物组及其应用。所述LAMP引物组由引物‑F3、引物‑B3、引物‑FIP和引物‑BIP组成，核苷酸序列依次如序列表中的序列1‑序列4所示。本发明的LAMP引物组可应用于鉴定待测皮蠹是否为或候选为谷斑皮蠹，也可应用于检测待测样本是否含有或候选含有谷斑皮蠹，以及区分谷斑皮蠹与其它皮蠹。通过实验证明：采用LAMP引物组鉴定谷斑皮蠹，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于鉴定谷斑皮蠹的LAMP引物组及其应用。

背景技术

皮蠹隶属鞘翅目(Coleoptera)，皮蠹科(Dermestidae)，在全世界广泛分布。其中，斑皮蠹属(Trogoderma)约有130种，在这130种中具有经济意义的有20余种。斑皮蠹的寄主范围广泛，可严重危害多种动植物性产品，除为害寄主外观、质量的同时，也严重影响对外贸易，导致巨大的经济损失。斑皮蠹属(非中国种)为我国进境植物检疫性有害生物，其入侵防控受到检疫部门的高度关注。

谷斑皮蠹Trogoderma granarium是我国进境检疫性有害生物，也是国际上最重要的检疫性有害生物之一，现主要分布于非洲、南亚、欧洲的局部地区。其主要寄主为各种谷物、干果、蔬菜种子、树胶等植物性产品，或奶粉、皮革、干动物尸体等干燥的动物性产品。幼虫是为害货物的主要虫态，具暴食、粉碎食物的特性。幼虫孵化后先取食谷类种子的胚芽，再取食胚乳，造成谷物种皮不规则状损伤。对于大批量货物，谷斑皮蠹常在表层进行危害，使货物表面覆盖大量幼虫蜕皮、断裂的刚毛及粪便，对原粮的储藏造成极大威胁，带来严重的污染与经济损失。谷物一般损失5％-30％，有时高达73％-100％。

谷斑皮蠹幼虫偏好藏于缝隙中，其成虫不具备飞行能力，因此主要的传播方式为贸易中的人为运输。近年来谷斑皮蠹在世界各口岸的拦截数量稳步增加，其危害日益受到各国的高度关注。由于口岸截获的皮蠹多为形态上极其近似的非成虫虫态，传统形态鉴定难度大、要求高、效率低。随着中欧贸易、“一带一路”建设的飞速发展，谷斑皮蠹传入我国的风险显著增加，其检疫鉴定特别是快速鉴定的需求愈发迫切。

分子鉴定由于不受皮蠹样品个体发育状态和形态特征是否完整的影响，被认为是形态学鉴定的有效补充方法。现有的PCR分子鉴定技术虽然可实现快速、准确的鉴定，但需昂贵的仪器设备，鉴定成本高，不适于在基层部门中推广应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。LAMP是一种简便高效的核酸恒温扩增技术，可以在短时间内大量扩增反应产物，具更高灵敏度，且操作简便，无需特殊仪器，检测结果可由肉眼观察判断，适于基层部门推广应用。LAMP中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何有效快速、准确地鉴定谷斑皮蠹。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于鉴定或辅助鉴定谷斑皮蠹的成套引物组。

本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定谷斑皮蠹的成套引物组由引物-F3、引物-B3、引物-FIP和引物-BIP组成；

所述引物-F3为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物-B3为如下a3)或a4)：