[发明专利]一种沉默长非编码RNA表达的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种沉默长非编码RNA表达的方法及其应用。本发明提供了用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的成对sgRNA，其一靶向所述长链非编码RNA任一内含子的BPS位点上游的序列，另一靶向所述长链非编码RNA同一内含子的3’SS位点下游的序列。本发明克服了现有技术不得不采用的切除启动子区域或插入polyA序列或切除全长基因以沉默长非编码RNA表达带来的技术难度和对附近基因的干扰。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种沉默长非编码RNA表达的方法及其应用。

背景技术

长非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200nt的RNA，由于缺乏开放阅读框，因此绝大多数的此类RNA不进行翻译。之前对于此类RNA认识不足时，认为其是细胞内的“暗物质”，但随着对RNA功能研究，越来越多的证据表明此类RNA也发挥着特殊的生物学功能。调节基因表达是一种重用的研究基因功能的技术方法。相比siRNA和ASO，CRISPR方法是一种较为成熟且有效的调控基因的技术方法，特别是定位在核内的lncRNA。然而，由于基因间的位置的复杂性，因此极大的限制了CRISPR方法的应用。这些不可使用CRISPR方法编辑的lncRNA大多存在共用启动子现象或外显子存在重叠，例如天然反义转录物NAT等。

与编码基因不同，单一SgRNA造成的移码突变难以沉默lncRNA的表达。目前常用的CRISPR调控基因表达的策略主要有敲除lncRNA的启动子和部分外显子或敲除整个lncRNA基因组。以上方法存在较大的缺陷，一是操作难度大，二是启动子区域存在较多的转录调控原件，敲除该区域可能影响到邻近基因的表达，特别是NAT。其次，真核基因存在较多的内含子，全基因的敲除可能会影响基因附近基因的表达。因此，本领域存在寻找沉默lncRNA表达的新型策略和高效筛选方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于沉默长非编码RNA表达的特殊方法，称为前体RNA剪接干扰法(IE法)。

第一方面，本发明要求保护一种用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的成对sgRNA。

本发明要求保护的用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的成对sgRNA，分别记作sgRNA-1和sgRNA-2；所述sgRNA-1靶向靶序列1，所述靶序列1为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中任一内含子的BPS位点(即branch point site，分支点序列)上游的序列；所述sgRNA-2靶向靶序列2，所述靶序列2为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中同一内含子的3’SS位点下游的序列。

进一步地，所述靶序列1可为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中任一内含子的BPS位点上游500-50bp的序列；所述靶序列2可为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中同一内含子的3’SS位点下游75-500bp的序列。

第二方面，本发明要求保护如下任一生物材料：

P1、能够转录得到前文第一方面所述成对sgRNA的DNA分子。

所述DNA分子可为两段DNA分子，一段转录所述sgRNA-1，另一段转录所述sgRNA-2。所述DNA分子也可为一段DNA分子，该段DNA分子既能够转录得到所述sgRNA-1，也能够转录得到所述sgRNA-2。

P2、含有P1中所述DNA分子的表达构建体(病毒载体或质粒)。

所述表达载体可为两个表达载体，一个用于表达所述sgRNA-1，另一个用于表达所述sgRNA-2。所述表达载体也可以为一个表达载体，该表达载体能够同时表达所述sgRNA-1和所述sgRNA-2。

P3、含有P2中所述表达构建体的重组菌。

如大肠杆菌，用于保存或扩繁所述表达构建体(质粒)。

P4、含有P2中所述表达构建体的重组细胞或重组细胞群。