[发明专利]一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法在审

专利信息
申请号: 202110086614.6 申请日: 2021-01-22
公开(公告)号: CN112852872A 公开(公告)日: 2021-05-28
发明(设计)人: 朱家乐;朱晓宇;张勇;李春启 申请(专利权)人: 杭州环特生物科技股份有限公司
主分类号: C12N15/85 分类号: C12N15/85;A01K67/027
代理公司: 杭州杭诚专利事务所有限公司 33109 代理人: 尉伟敏;何俊
地址: 310051 浙江省杭*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 一种 用于 直接 检测 环境 雌激素 转基因 斑马 构建 方法
【权利要求书】:

1.一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法,其特征在于包括如下步骤:

(1)克隆斑马鱼雌激素响应元件ERE的DNA序列:合成获得5×ERE序列片段;

(2)构建质粒Tol2-5×ERE-GFF:将5×ERE序列片段融合入含一个GFF元件的质粒中,得到对雌激素有响应的Tol2-5×ERE-GFF质粒;

(3)胚胎显微注射及功能验证:将步骤(2)所得质粒注射至Tg(UAS:EGFP)转基因斑马鱼的受精卵中,并使用雌激素验证其雌激素荧光响应功能;

(4)Founder筛选:以步骤(3)所得受精卵长成的斑马鱼作为F0代,对F0代斑马鱼进行可遗传性筛选及PCR鉴定,将F0代斑马鱼与野生型AB品系斑马鱼杂交传至F1代,通过PCR鉴定目的基因是否插入到F1代斑马鱼的基因组中;

(5)纯种筛选培养:对通过鉴定的F1代斑马鱼进行培养,获得能够监测水体中环境雌激素的转基因斑马鱼系。

2.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(1)中,合成5×ERE序列片段后将其克隆到pUC57载体上。

3.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)具体为:

先通过PCR分别扩增以下片段:

通过上下游引物vector-F和vector-R扩增载体Tol2,模板为质粒Tol2-C1;其中vector-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,vector-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;

通过上下游引物GFF-F1和GFF-R1扩增GFF和SV40 poly(A)片段,模板为质粒T-GFF;其中GFF-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,GFF-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;

通过上下游引物ERE-F和ERE-R扩增5×ERE片段,模板为pUC57-5×ERE;其中ERE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,ERE-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;

然后将各个片段用试剂盒Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit连接,转入DH5α感受态中,涂布于含有Ampicillin的LB平板上培养,得到核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的Tol2-5×ERE-GFF质粒。

4.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中:将纯化后的Tol2-5×ERE-GFF质粒和TPase mRNA混合后共注射,其中两者的注射量比为(0.8-1.2):1;注射完成后的受精卵于25-30℃的培养基培养。

5.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中:注射阶段为受精卵的单细胞期。

6.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中:使用雌激素验证其雌激素荧光响应功能的过程为:在受精后将注射过的幼鱼浸泡于含有诱导剂的溶液中,在恒温培养箱中培养,最终利用荧光显微镜成像,进行验证。

7.如权利要求6所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中:所述诱导剂为3-7μg/L的雌二醇或3-7μg/L的雌二醇+3-7μM的4-OHT。

8.如权利要求6所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中:

在受精后3天将注射过的幼鱼浸泡于含有诱导剂的溶液中;和/或

培养箱的培养条件为25-30℃,14/10h光周期;和/或

荧光显微镜成像的条件为:3.2倍,曝光250ms。

9.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(4)中:对F1代斑马鱼的鉴定方法为:设计鉴定引物ERE-F1和ERE-R1,提取10-20条斑马鱼幼鱼的基因组,用鉴定引物进行PCR鉴定;其中ERE-F1和ERE-R1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8-9所示。

10.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(5)具体为:对通过鉴定的F1代斑马鱼成鱼分别与野生型AB品系斑马鱼 杂交产F2代,然后进行功能验证,选择通过验证的F2代进行养殖,F2代成鱼自交,获得F3代,F3代中纯合子比例理论上为 1/4,F3代通过鉴定的成鱼分别与AB品系杂交,若后代均呈阳性,则为纯合子,筛选纯合子继续培养。

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