[发明专利]一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法

说明书

本发明涉及基因工程与环境科学领域，公开了一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法，包括：（1）克隆斑马鱼雌激素响应元件ERE的DNA序列；（2）构建质粒Tol2‑5×ERE‑GFF；（3）胚胎显微注射及功能验证；（4）Founder筛选；（5）纯种筛选培养。按本发明方法所得的转基因斑马鱼中，雌激素能刺激5×ERE响应，激活GFF的表达，而GFF蛋白可与UAS结合，进而驱动绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，从而达到方便、直观、动态检测环境雌激素是否存在及其浓度的目的。

技术领域

本发明涉及基因工程与环境科学领域，尤其涉及一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法。

背景技术

环境雌激素(EnvironmentalEstrogens，EEs)是一类环境中存在的能干扰内分泌系统的正常生理和生化功能的化学物质，三大主要的EEs有1、人工合成雌激素，2、生物来源雌激素，3、环境化学污染物。EEs一般以较低浓度存在于环境中，可在生物体内富集并诱导生物体神经、生殖、免疫系统疾病及肿瘤等多种病变。EEs污染问题已引起广泛关注。

EEs的检测方法主要可分为理化检测和生物学检测两大类。其中，理化方法如气相色谱(GC)法、液相色谱(LC)、电感耦合等离子发射光谱(ICP)及其相关的质谱(MS)联用分析等偏向于检测化学结构已知的物质，对新的雌激素类化合物的筛查有局限性，且前处理复杂。生物学方法分为体外和体内实验。体外实验如雌激素敏感细胞和酵母菌检测系统，检测灵敏度较高，但不能全面反应雌激素毒性。子宫生长试验是经典的体内检测雌激素活性的方法，优点是可以检测某些需要在体内代谢活化的活性物质和中间代谢产物等，但灵敏度较低，影响因素较多，且结果难以外推到人。

欧洲经济与合作发展组织(OECD)和日本的生殖毒理学家采用斑马鱼(Zebrafish)作为检测水环境内分泌干扰物浓度的早期敏感对象。

斑马鱼具有个体小、繁殖率高、生长周期短、胚胎透明、与人类基因的同源性高、易于进行转基因操作并得到基因突变体，成为研究脊椎动物环境毒理学的理想模式生物。

斑马鱼中有三个基因与哺乳动物雌激素受体(ERs)同源：erα(在斑马鱼中也称为nr3a1或esr1)、erβ1(nr3a2a或esr2a)和erβ2(nr3a2b或esr2b)。三种雌激素受体均可与雌激素响应元件(ERE)DNA序列结合，并以剂量依赖的方式激活胞内转录。

发明内容

本发明提供了一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法，按照本发明方法所得的转基因斑马鱼中，雌激素能刺激5×ERE响应，激活GFF的表达，而GFF蛋白可与UAS结合，进而驱动绿色荧光蛋白(EGFP)的表达，从而达到方便、直观、动态检测环境雌激素是否存在及其浓度的目的。

本发明的具体技术方案为：

一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法，包括如下步骤：

(1)克隆斑马鱼雌激素响应元件ERE的DNA序列：合成获得5×ERE序列片段。

(2)构建质粒Tol2-5×ERE-GFF：将5×ERE序列片段融合入含一个GFF元件的质粒中，得到对雌激素有响应的Tol2-5×ERE-GFF质粒。

(3)胚胎显微注射及功能验证：将步骤(2)所得质粒注射至Tg(UAS：EGFP)转基因斑马鱼的受精卵中，并使用雌激素验证其雌激素荧光响应功能。

(4)Founder筛选：以步骤(3)所得受精卵长成的斑马鱼作为F0代，对F0代斑马鱼的可遗传性筛选及PCR鉴定，将F0代斑马鱼与野生型AB品系斑马鱼杂交传至F1代，通过PCR鉴定目的基因是否插入到F1代斑马鱼的基因组中。

(5)纯种筛选培养：对通过鉴定的F1代斑马鱼进行培养，获得能够监测水体中环境雌激素的转基因斑马鱼系。