[发明专利]一种肠道病毒EV71型病毒样颗粒、编码基因、表达载体、重组酵母菌及制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种肠道病毒EV71型病毒样颗粒、其编码基因、表达载体、重组酵母菌及其制备方法和应用，属于生物免疫技术重组蛋白表达技术领域。在本发明中，所述病毒样颗粒由EV71病毒的P1前体蛋白的四个结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4在酵母细胞内自组装获得。四个结构蛋白经重组酵母载体表达后自动组装为形态均一稳定且具有免疫原性的病毒样颗粒，证明了在P1蛋白的四个结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4单独存在下，EV71病毒样颗粒在酵母细胞内可完全组装，不需要3CD蛋白酶，从而进一步简化了肠道病毒EV71型病毒样颗粒的构建方法。将本发明所述肠道病毒EV71型病毒样颗粒制成疫苗，具有良好的免疫原性。

技术领域

本发明属于生物免疫技术重组蛋白表达技术领域，具体涉及一种肠道病毒EV71型病毒样颗粒、其编码基因、表达载体、重组酵母菌及其制备方法和应用。

背景技术

手足口病是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主，该病传染性强，易引起暴发或流行。近年来，该病的流行在亚太地区呈上升趋势，并引起了无菌性脑脊髓膜炎、脑炎、心肌炎、肺水肿等众多的严重并发症，受到了人们的广泛重视。引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒(CoxV)和埃可病毒(EchoV)的某些血清型。EV71基因组为7408个核苷酸(BrCr株)的单股正链RNA，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白。CoxV可分A和B组，分别有24个和6个血清型，感染人体的CoxV以A组居多，引起手足口病的CoxV以A16为主，A4、A7、B2、B5、B13等偶尔也可引起。EchoV最早在脊髓灰质炎流行期间从人的粪便中分离来，又称人类肠道致细胞病变孤儿病毒，大致有30余个血清型，其中某些血清型(如11型)可以引起手足口病。自1957年首次报道该病以来，分离出的病原体多样，均为单股正链RNA病毒，小RNA病毒科，肠道病毒属。

肠道病毒EV71基因约7389到7408个核苷酸组成，仅有一个开放阅读框，并编码含约2190余个氨基酸的多聚蛋白，多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2和P3三个前体蛋白。P1前体蛋白可降解成VP1、VP2、VP3和VP4四个病毒外壳蛋白；P2和P3前体蛋白可降解成七个非结构蛋白，在进化过程中高度保守。EV71病毒颗粒均为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径约为30nm，病毒由外层蛋白衣壳和内部的RNA核心构成。蛋白衣壳首先由VP1、VP2、VP3和VP4分子构成原聚体，再由5个原聚体构成一个亚单位，60个这样的亚单位形成二十面体对称结构的球形衣壳。四中结构衣壳中，VP1、VP2和VP3暴露于外表面，而VP4蛋白包埋在内侧与RNA核心相连。病毒的VP1蛋白在不同株的病毒间差异较大，且该蛋白在病毒的免疫原性、与宿主细胞表面特异性受体结合及病毒的脱壳等过程发挥着重要作用。同时，VP2和VP3蛋白上也含有一定的抗原决定簇。

手足口病疫苗在现阶段的研究主要以引起手足口病的EV71病毒为方向。EV71病毒C4亚型VP4蛋白N端前20个氨基酸的基因融合入乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因中，克隆到pet载体，利用大肠杆菌表达系统表达HBc-N149-VP4-N20，诱导表达形成VLP颗粒，能有效保护EV71病毒的感染。

目前国内外多家研究机构都在进行EV71病毒样颗粒疫苗的研制，EV71病毒样颗粒的组装是通过在同一细胞中共表达EV71的病毒蛋白酶3CD及P1前体蛋白，通过3CD蛋白酶加工处理P1蛋白后产生4种结构蛋白，在细胞内自行组装成类病毒颗粒，该病毒颗粒不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性，免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化。因此，VLP疫苗已成为预防性EV71疫苗发展的主要方向。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明提供了如下技术方案：