[发明专利]一种含有人皮肤细胞复合生长因子的修复液及其制备方法

权利要求书

1.一种含有人皮肤细胞复合生长因子的修复液，其特征在于，所述修复液以体积百分比包括：成纤维细胞生长因子浓缩液48.5％-49.95％，表皮细胞生长因子浓缩液48.5％-49.95％；蜂胶0.05％-1％；透明质酸0.05％-2％。

2.根据权利要求1所述的一种含有人皮肤细胞复合生长因子的修复液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

皮肤样本处理：在无菌条件下，取用户本人双眼皮皮肤组织置于保存液中，4℃保存；然后用无菌的组织镊取出所述双眼皮皮肤组织于无菌培养皿中，用生理盐水清洗至无血迹，然后用无菌剪刀剪成1×5mm的条形状；用dispaseII酶消化，用生理盐水稀释后，离心，弃掉dispaseII酶，用无菌的组织镊将表皮层与真皮层分开；

真皮成纤维细胞和表皮细胞培养：用剪刀分别将所述表皮层和所述真皮层分别剪碎至1×1×1mm大小的组织块；再用胶原酶II分别消化所述表皮层的组织块和所述真皮层的组织块；然后分别加入生理盐水稀释，离心，弃掉上清；将处理后的所述真皮层的组织块吹悬成纤维细胞，接种于T75培养瓶中；将处理后的所述表皮层的组织块吹悬表皮细胞接种于第一培养瓶中；

将所述T75培养瓶和所述第一培养瓶分别每2-3天换液一次，待所述成纤维细胞和所述表皮细胞融合度均达到90％时，分别用胰酶消化传代；待传至6代，所述成纤维细胞和所述表皮细胞融合度均达到90％时，均弃掉培养上清，将所述T75培养瓶更换为DMEM基础培养基，将所述第一培养瓶更换为EPlife基础培养基，分别培养三天，分别收集成纤维细胞培养上清和表皮细胞培养上清于两个无菌瓶中，再均用胰酶进行消化传代；然后离心，浓缩，调节pH，过滤除菌，分别得到成纤维细胞生长因子浓缩样品和表皮细胞生长因子浓缩样品；

制备修复液：无菌环境下，将所述成纤维细胞生长因子浓缩样品和所述表皮细胞生长因子浓缩样品混合，按照比例加入所述透明质酸和用酒精溶解后的所述蜂胶，充分搅拌直至完全混合均匀，在4℃环境下静置2h，消除泡沫，得到所述修复液。

3.根据权利要求2所述的一种含有人皮肤细胞复合生长因子的修复液的制备方法，其特征在于，在所述皮肤样本处理中，用无菌剪刀将所述双眼皮皮肤组织剪成1×5mm的条形状后；用浓度为0.1U/ml的dispaseII酶4℃消化3h，用生理盐水稀释后，离心，弃掉dispaseII酶。

4.根据权利要求3所述的一种含有人皮肤细胞复合生长因子的修复液的制备方法，其特征在于，在所述真皮成纤维细胞和表皮细胞培养中，用剪刀分别将所述表皮层和所述真皮层分别剪碎至1×1×1mm大小的组织块后，用浓度0.2％的胶原酶II 37℃下分别消化所述表皮层的组织块和所述真皮层的组织块2h。

5.根据权利要求4所述的一种含有人皮肤细胞复合生长因子的修复液的制备方法，其特征在于，在所述真皮成纤维细胞和表皮细胞培养中，用胶原酶II分别消化所述表皮层的组织块和所述真皮层的组织块后，先用完全培养基终止消化，然后再分别加入生理盐水稀释，在2000rpm/min下离心10min。

6.根据权利要求5所述的一种含有人皮肤细胞复合生长因子的修复液的制备方法，其特征在于，在所述真皮成纤维细胞和表皮细胞培养中，将处理后的所述真皮层的组织块吹悬成纤维细胞，计数，以1×10⁶接种于所述T75培养瓶中；将处理后的所述表皮层的组织块吹悬表皮细胞，计数，以1×10⁶接种于所述第一培养瓶中。

7.根据权利要求6所述的一种含有人皮肤细胞复合生长因子的修复液的制备方法，其特征在于，将处理后的所述表皮层的组织块吹悬表皮细胞接种于所述第一培养瓶中后，将所述第一培养瓶置于37℃5％二氧化碳培养箱中。