[发明专利]一种全预混RT-PCR反应体系及其应用

说明书

本发明涉及一种全预混RT‑PCR反应体系及其应用，所述反应体系包括：缓冲物质、阳离子、脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶、逆转录酶和PCR稳定剂；其中所述PCR稳定剂包括：选自BSA、海藻糖、葡聚糖、DMSO、甲酰胺、PEG8000和甘油中的至少三种。本发明针对现有技术中RT‑PCR反应体系需现配现用或不稳定的问题，将反应体系中各组分混合在一起，并添加有PCR稳定剂，可有效保护体系中多种酶的活性，避免蛋白变性，并减少二聚体的产生，从而显著提高了全预混RT‑PCR反应体系的稳定性，并且减少了各组分的配制准备时间，可随取随用，省时省力，同时显著减少了由于反复取用混合导致的实验误差和实验污染。

技术领域

本发明属于反转录PCR技术领域，具体涉及一种全预混RT-PCR反应体系及其应用。

背景技术

聚合酶链反应(PCR)是一种简单、快速、灵敏地体外放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，这项技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可短时间内在反应管中获得数百万个特异DNA序列拷贝，反转录PCR(RT-PCR)则是在PCR的基础上加入了反转录酶，以RNA为原始模板进行扩增得到DNA的方法

常规的RT-PCR反应体系是将酶、buffer等多个组分单独保存，待使用时将各组分分别加入混匀后再分装至反应管中，然后分开保存并混合时，在操作过程中不仅容易出现加错或漏加的情况，还会由于多次反复取用，导致试剂被污染，进而影响后续的使用。然而如果直接将酶系和buffer等组分混合在一起得到RT-PCR预混液并保存后，会出现反应体系不稳定，检测效果变差的问题，从而影响了后续的正常使用。

发明内容

本发明针对现有技术中RT-PCR反应体系每次使用时都需要现配现用，而将各组分直接预混的RT-PCR反应体系不稳定的技术问题，提供了一种全预混RT-PCR反应体系及其应用，通过将反应体系中各组分混合在一起，并添加有PCR稳定剂，从而显著提高了全预混RT-PCR反应体系的稳定性，并且该反应体系可随取随用，省时省力，同时减少实验误差，降低实验污染。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种全预混RT-PCR反应体系，包括：缓冲物质、阳离子、脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶、逆转录酶和PCR稳定剂；

所述PCR稳定剂包括：选自BSA、海藻糖、葡聚糖、DMSO、甲酰胺、PEG8000和甘油中的至少三种。

本发明在反应体系中加有PCR稳定剂，其中BSA(牛血清白蛋白)、海藻糖以及葡聚糖可减少反应体系在低温保存时冰晶的形成，进而保护体系中酶的活性；PEG8000和甘油能够防止冷冻保存引起的浓缩效应导致蛋白质分子内、分子间二硫键交换反应增加，进一步避免了体系中酶的失活和变性；同时体系中的甲酰胺和DMSO(二甲基亚砜)能够减轻逆转录酶与引物探针在低温条件下的相互作用，避免二聚体的形成，从而进一步增强了全预混RT-PCR反应体系的稳定性。

进一步的，所述PCR稳定剂包括：选自0.1～1mg/mL BSA，0.1～0.3M海藻糖、1％～3％葡聚糖、1％～3％DMSO、2％～4％甲酰胺、1％～3％PEG8000和1％～5％甘油中的至少三种。其中所述百分比为体积百分比。

进一步的，所述反应体系中还包括UNG酶和核糖核酸酶抑制剂。其中UNG酶用于预防非特异性PCR扩增和污染，核糖核酸酶抑制剂用于保护RNA模板，即抑制污染物中RNA酶对于体系中RNA模板的降解。

进一步的，所述缓冲物质为浓度为5～100mmol/L的Tris类缓冲物质和/或两性离子缓冲物质。

进一步的，所述缓冲物质的浓度为10～60mmol/L。

进一步的，所述Tris类缓冲物质选自Tris盐酸缓冲液和Tris硫酸缓冲液中的至少一种；所述两性离子缓冲物质选自Tricine缓冲液和Bicine缓冲液中的至少一种。