[发明专利]一种快速准确检测血清中总胆固醇的方法

权利要求书

1.一种快速准确检测血清中总胆固醇的方法，步骤是：

(1)基于检测胆固醇氧化酶(Chox)酶促反应产物H₂O₂的纳米多孔金(NPG)/丝网印刷(SPE)试纸条制备及表征；

(2)以试纸条校定基于检测胆固醇氧化酶(Chox)酶促反应产物H₂O₂对应的胆固醇浓度线性关系，做出胆固醇浓度线性标准曲线；

(3)以血清为实际样本，检测血清中总胆固醇含量；

其特征在于：

步骤(1)所述基于检测胆固醇氧化酶(Chox)酶促反应产物H₂O₂的纳米多孔金(NPG)/丝网印刷(SPE)试纸条制备及表征的方法是：

将厚度为100±10nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在40±2℃温度下，腐蚀1～2小时，制得纳米多孔金薄膜NPG，将制得的纳米多孔金薄膜固定在丝网印刷试纸条的工作电极表面，并在NPG表面滴加1.5～2μL 0.05％的Nafion，室温晾干，即制得NPG/SPE试纸条；所述试纸条工作电极为NPG修饰的碳电极，Ag/AgCl为参比电极，碳电极为对电极；将制备好的NPG/SPE试纸条在0.5M H₂SO₄中进行循环伏安法扫描20圈，以还原峰峰电流表征其有效面积；

步骤(2)所述以试纸条校定基于检测胆固醇氧化酶(Chox)酶促反应产物H₂O₂对应的胆固醇浓度线性关系，做出胆固醇浓度线性标准曲线的方法是：

将胆固醇用异丙醇溶解后按0～6mM的不同浓度分别加入含有0.1％Triton X-100的50mM、pH 7磷酸钾缓冲液中，然后在该缓冲体系中再加入终浓度为0.02mg/mL异源表达的胆固醇氧化酶(Chox)，在37℃反应10分钟；然后取反应液100μL滴加在试纸条工作电极表面，利用循环伏安法，以50mV s^-1的扫速在-1.3～+0.1V电压范围内检测；依次将不同浓度的胆固醇检测得到的峰电流值j对应胆固醇浓度作图，得到胆固醇浓度线性标准曲线；

步骤(3)所述以血清为实际样本，检测血清中总胆固醇含量的方法是：

取待测血清样本，用50mM、pH 7磷酸钾缓冲液将血清稀释3～5倍，加入终浓度为0.05mg/mL的胆固醇酯酶在45℃～50℃条件下反应10～30分钟，然后在血清中加入终浓度为0.02mg/mL异源表达的胆固醇氧化酶(Chox)，在37℃条件下反应10～20分钟；然后取反应液100μL滴加在试纸条工作电极表面，利用循环伏安法，以50mV s^-1的扫速在-1.3～+0.1V电压范围内检测，将得到的峰电流值代入胆固醇浓度线性标准曲线中即可相应得到血清中总胆固醇的浓度。

2.根据权利要求1所述快速准确检测血清中总胆固醇的方法，其特征在于，步骤(1)所述NPG/SPE试纸条的制备方法是：

将厚度为90nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在38℃温度下，腐蚀2小时，制得纳米多孔金薄膜NPG，将制得的纳米多孔金薄膜固定在丝网印刷试纸条的工作电极表面并擦除工作电极外多余的NPG，然后在NPG表面滴加1.5μL 0.05％的Nafion，室温晾干，即制得NPG/SPE试纸条。

3.根据权利要求1所述快速准确检测血清中总胆固醇的方法，其特征在于，步骤(3)所述以血清为实际样本，检测血清中总胆固醇含量的方法是：

取待测血清样本，用50mM、pH 7磷酸钾缓冲液将血清稀释5倍，加入终浓度为0.05mg/mL的胆固醇酯酶在45℃条件下反应15分钟，然后在血清中加入终浓度为0.02mg/mL异源表达的胆固醇氧化酶(Chox)，在37℃条件下反应10分钟；然后取反应液100μL滴加在试纸条工作电极表面，利用循环伏安法，以50mV s^-1的扫速在-1.3～+0.1V电压范围内检测，将得到的峰电流值代入胆固醇浓度线性标准曲线中即可相应得到血清中总胆固醇的浓度；其中标准对照以商品化试剂盒检测结果为校准值。