[发明专利]一种乏氧响应的基因编辑方法

权利要求书

1.一种乏氧响应的基因编辑方法，其特征在于包括如下步骤：

将乏氧响应性纳米复合材料APACP与含目标基因的细胞进行混合，对羧基偶氮苯在肿瘤乏氧微环境中发生特异性还原，导致偶氮键断裂，在乏氧条件下，实现共价连接在乏氧响应性纳米复合材料APACP上的Cas9/sgRNA精确可控释放，并基于CRISPR-Cas9系统实现了有效的基因编辑，在红外光照射下实现对肿瘤部位治疗，所述目标基因的具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的乏氧响应的基因编辑方法，其特征在于：所述的目标基因包括EGFP基因和HSP90α基因，细胞为A549肺癌细胞，小鼠为BALB/c裸鼠，在肿瘤乏氧微环境中，N-N双键被破坏，Cas9/sgRNA复合物可控释放，用于在肿瘤部位特异性地敲除Hsp90α基因。

3.根据权利要求2所述的乏氧响应的基因编辑方法，其特征在于：所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP中，采用的红外光波长为808nm，光照时长为20min。

4.根据权利要求3所述的乏氧响应的基因编辑方法，其特征在于：所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP由Cas9/sgRNA和经对羧基偶氮苯p-AZO修饰的AuNRs组成，并在静电吸附的作用下，在最外层包裹上带正电的聚乙烯亚胺PEI，制得乏氧响应性纳米复合材料APACP。

5.根据权利要求4所述的乏氧响应的基因编辑方法，其特征在于：通过种子生长法制备金纳米棒，通过巯基键将SH-PEG-NH₂连接到金纳米棒上，然后将AuNPs-SH-PEG-NH₂共价连接到对羧基偶氮苯上，接着将Cas9/sgRNA复合物共价连接至对羧基偶氮苯p-AZO的另一端，以形成APAC，为了促进细胞对纳米载体的吸收，APAC被带正电的聚乙烯亚胺PEI包裹起来形成乏氧响应性纳米复合材料APACP。

6.根据权利要求5所述的乏氧响应的基因编辑方法，其特征在于：在室温下，在Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液的pH为7.4，以1:3的Cas9：sgRNA质量比将Cas9蛋白与sgRNA孵育10分钟，以形成Cas9/sgRNA复合物。

7.根据权利要求5所述的乏氧响应的基因编辑方法，其特征在于：

采用CTAB介导的种子生长法制备金纳米棒AuNR5×10^-9nmol，0.0040g巯基-聚乙二醇-氨基SH-PEG-NH₂与AuNR溶液在37℃下反应12小时，获得SH-PEG-NH₂-AuNR；用0.0384g N-乙基-N'-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺EDC和0.0058g N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化0.0036g对羧基偶氮苯的羧基半小时，然后将对羧基偶氮苯溶液加入前一步骤得到的产物中，在37℃下孵育过夜，形成APA；在室温下，在Tris-HCl缓冲液中，将2.5μg Cas9蛋白与7.5μgsgRNA孵育10分钟，以形成Cas9/sgRNA复合物，将活化的APA与Cas9/sgRNA复合物混合，并在4℃的冰箱中保存过夜，将PEI溶液以与加入sgRNA质量比为5：1的比例转移至上述产物中，并在摇动3分钟，制得乏氧响应性纳米复合材料APACP。

8.根据权利要求4所述的乏氧响应的基因编辑方法，其特征在于：所述的Cas9蛋白与sgRNA的质量比为1:3，所述的Tris-HCl缓冲液的pH为7.4；所述的聚乙烯亚胺PEI与加入sgRNA质量比为3:1；所述的聚乙烯亚胺的分子量为10000。

9.权利要求1至8任一项所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP在治疗抗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤细胞为A549，当把该复合体递送进细胞或者小鼠，实现Cas9对HSP90α基因的精准递送和敲除，同时通过AuNRs将近红外光转化为细胞内的热能，以实现对HSP90α基因敲除的靶向肿瘤细胞的低温热疗。