[发明专利]一种乏氧响应的基因编辑方法

说明书

本发明公开了一种乏氧响应的基因编辑方法。本发明的纳米复合材料APACP由Cas9/sgRNA和经对羧基偶氮苯修饰的AuNRs组成，并在最外层裹上一层聚乙烯亚胺PEI。对羧基偶氮苯在肿瘤乏氧微环境中发生特异性还原，导致偶氮键断裂，从而实现共价连接在APACP纳米粒子上的Cas9/sgRNA精确可控释放，并基于CRISPR‑Cas9系统实现了有效的基因编辑。根据AuNRs的光热转化特性，在Cas9/sgHSP90敲除肿瘤组织中的靶基因后，本发明用光热疗法治疗肿瘤。细胞和动物实验已证实该处理方法有效且优于AuNRs光热处理，也证明了APACP纳米颗粒在肿瘤治疗中的广泛潜力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乏氧响应的基因编辑方法。

背景技术

簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白9(Cas9)技术是当前最为热门的一种基因编辑工具，在基因编辑和疾病治疗中起着至关重要的作用。到目前为止，人们已经开发了各种方法，以递送CRISPR-Cas9系统。然而，如何高效、可控地靶向递送CRISPR-Cas9系统仍存在很多挑战。乏氧是大多数实体肿瘤微环境中的普遍特征，考虑到肿瘤的乏氧微环境和偶氮键的乏氧响应性，使得解决CRISPR-Cas9技术有效肿瘤靶向和可控递送问题成为可能。另一方面，光热疗法(PTT)利用光热材料产生的热能来杀伤癌细胞，然而，由于激光诱导的非特异性热能的扩散，高温对周围正常组织造成热损伤。肿瘤细胞的耐热性主要是由热激蛋白90(HSP90)引起的，而Hsp90α是Hsp90的主要亚型。通过以Hsp90α为靶点的CRISPR-Cas9系统和乏氧响应性方法构建的平台，为低温下光热疗法效率的最大化提供了一条有前途的方法。

发明内容

为构建以Hsp90α为靶点的CRISPR-Cas9系统和乏氧响应性平台，本发明将对羧基偶氮苯(p-AZO)一端连接到巯基-聚乙二醇-氨基(SH-PEG-NH₂)修饰的金纳米棒上，另一端连接到由Cas9和靶向Hsp90α基因的sgRNA复合物上。

在肿瘤乏氧微环境中，N-N双键被破坏，Cas9/sgRNA复合物可控释放，用于在肿瘤部位特异性地敲除Hsp90α基因。利用金纳米棒的光热转换作用，应用近红外(NIR)光(808nm)对HSP90α基因敲除的肿瘤细胞进行温和热疗。

为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种乏氧响应的基因编辑方法，包括如下步骤：将乏氧响应性纳米复合材料APACP与含目标基因的细胞进行混合，目标基因序列为:5′-ATTCCCTGTCACCGCGTCAC-3′，对羧基偶氮苯在肿瘤乏氧微环境中发生特异性还原，导致偶氮键断裂，在乏氧条件下，实现共价连接在乏氧响应性纳米复合材料APACP上的Cas9/sgRNA精确可控释放，并基于CRISPR-Cas9系统实现了有效的基因编辑，在红外光照射下实现对肿瘤部位治疗，所述目标基因的具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述的目标基因包括EGFP基因和HSP90α基因，细胞为A549肺癌细胞，小鼠为BALB/c裸鼠，在肿瘤乏氧微环境中，N-N双键被破坏，Cas9/sgRNA复合物可控释放，用于在肿瘤部位特异性地敲除Hsp90α基因。

进一步地，所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP中，采用的红外光波长为808nm，光照时长为20min。

更进一步地，所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP由Cas9/sgRNA和经对羧基偶氮苯p-AZO修饰的AuNRs组成，并在静电吸附的作用下，在最外层包裹上带正电的聚乙烯亚胺PEI，制得乏氧响应性纳米复合材料APACP。

进一步地，在室温下，在Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液的pH为7.4，以1:3的Cas9：sgRNA质量比将Cas9蛋白与sgRNA孵育10分钟，以形成Cas9/sgRNA复合物。