[发明专利]一种豇豆原位转化方法

说明书

本发明提供了一种豇豆原位转化方法，包括以下步骤：对豇豆种子催芽至子叶节完全露出，获得转化受体；制备含有表达载体和目的基因的农杆菌的浸染液；在负压条件下，将所述转化受体浸泡在所述浸染液中进行浸染；将浸染后的转化受体移入土壤进行培育，两周后筛选幼苗中的阳性植株。相对于传统的组培方法，本方法可有效提高豇豆种子的转化率，且操作方便，培育效率高，成本低。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种豇豆原位转化方法。

背景技术

豇豆(Vigna unguiculata L.Walp)营养丰富，富含蛋白质、维生素和矿物质，栽培面积大，是最重要的栽培豆类作物之一。

豇豆固有基因多样性较低，且具有较强的杂交不亲和性，传统的育种方式在豇豆育种中收效甚微,转基因技术为豇豆育种提供了一条有效的途径。通过农杆菌介导的原位转化法可对豇豆进行转化，但是传统的农杆菌介导的原位转化法一般用组培方法转化，传统的组培方法一般包括以下步骤：

第一步，浸染：采用有创伤的豇豆子叶节作为转化受体，进行农杆菌浸染。

第二步，共培：浸染后的子叶节在无菌条件下，在培养基中进行共培养，所需时间在1周左右。

第三步，再生苗诱导：将共培后的子叶节插入到芽诱导培养基中，培养2周时间，待新芽长出后，将新芽再次转接到培养基中进行再生苗诱导，大约需要2周时间。

第四步，生根诱导和炼苗：将第三步中培育再生苗切下，转接到生根培养基中，诱导生根，大概需要1周时间；将诱导生根后的幼苗取出后，洗净根部的培养基，移栽到育苗盘中，继续培育约2周时间左右，可移栽至土壤中进行培育。

传统的组培方法存在操作繁琐，成本高、周期长的缺陷，而且该方法的转化率较低，一般在1％左右。对某些特定的豇豆种子而言，用传统的组培方法甚至不能进行转化。发明人采用传统的组培方法对金福临门品种的豇豆始终未转化成功过。因此如何采用简单、快捷的原位转化法，提高豇豆的转化率，成功实现某些特定品种豇豆的转化，是本技术领域一直渴望解决但始终未成功的技术难题。

发明内容

基于此，本发明提供了一种豇豆原位转化方法，该方法采用子叶节完全露出的整颗豇豆种子为受体，在负压条件下进行浸染后，将浸染后的种子在土壤中进行培育，可明显提高转化率，简化操作过程，缩短转化周期。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：

一种豇豆原位转化方法，包括以下步骤：

对豇豆种子催芽至子叶节完全露出，获得转化受体；

制备含有表达载体和目的基因的农杆菌的浸染液；

在负压条件下，将所述转化受体浸泡在所述浸染液中进行浸染；

将浸染后的转化受体移入土壤进行培育，两周后筛选幼苗中的阳性植株。

在其中一个实施例中，所述农杆菌为C58、表达载体为 pCAMBIA1300，目标基因为Cry1C。

在其中一个实施例中，所述浸染液OD₆₀₀值为0.6-0.8，负压压强为0.06MPa-0.08MPa，浸染时间为60s-150s。

在其中一个实施例中，所述浸染液OD₆₀₀值为0.6-0.8，负压压强为0.07MPa-0.08MPa，浸染时间为120s。

在其中一个实施例中，所述农杆菌为GV3101、表达载体为pHellsgate8，目标基因为SUN。

在其中一个实施例中，所述农杆菌为GV3101、表达载体为 pHellsgate8，目标基因为GLK2。