[发明专利]一种生物转化法合成胆红素的方法

说明书

本发明公开了一种生物转化法合成胆红素的方法，将表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌菌株产酶培养后的发酵液离心，收集菌体，经蒸馏水洗涤后作为生物催化剂，以pH 5.8、0.1mol/L的柠檬酸缓冲液为反应介质，加入胆绿素为底物，以甲醇为助溶剂构成转化体系，在35–37℃、100–200r/min恒温振荡条件下转化10–14h，转化反应结束后，将转化液离心，收集菌体，获得含胆红素的菌体，分离提取，获得胆红素。本发明含胆红素的菌体中胆红素的含量最高可达2.02％，是猪胆汁中胆红素含量0.05％的40.4倍，从菌体中提取胆红素的步骤相对简单，对降低胆红素的生产成本具有显著效果。

(一)技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用表达胆绿素还原酶的基因重组大肠杆菌，生物转化胆绿素合成胆红素的方法。

(二)背景技术

胆红素(bilirubin，CAS号635-65-4)是在一些生物体产生的一类胆色素，主要由血红素(heme，CAS号14875-96-8)降解产生。在人体中，衰老的红细胞在单核吞噬细胞系统的作用下，释放出血红蛋白，血红蛋白随后被分解成球蛋白和血红素。血红素在血红素加氧酶(heme oxygenase，简称HO，EC 1.14.99.3)的作用下，将卟啉环氧化断裂而成为胆绿素(biliverdin，CAS号114-25-0)，胆绿素进而被胆绿素还原酶(biliverdin reductase，简称BvdR，EC l.3.1.24)还原生成胆红素。

健康正常的成年人个体每天产生约300mg胆红素，胆红素如果过量存在，会在大脑中堆积，使人易患精神疾病，或导致脑部组织受损，如新生儿核黄疸，所以在很长一段时间内，胆红素都被认为是有毒的代谢产物。但是近年来，越来越多的研究显示胆红素是人体内发挥重要抗氧化作用的脂溶性抗氧化剂，当血清胆红素水平正常或稍高时，胆红素具有强大的抗氧化和抗炎能力，能够清除体内的过氧化氢自由基、氧自由基，其抑制脂蛋白氧化的能力是维生素E类似物的30倍，在预防糖尿病和冠心病方面发挥着重要的作用。

胆红素是牛黄的主要成分之一，牛黄是珍稀名贵中药材，具有极高的药用价值。2015版药典中牛黄类药品多达50余种，包括牛黄解毒片、安宫牛黄丸、牛黄上清胶囊等，但是天然牛黄来源稀少。为了缓解天然牛黄药源短缺，我国药学工作者在上个世纪70年代根据天然牛黄的成分，成功地研制出人工牛黄。但是，人工牛黄中胆红素的含量与天然牛黄还是存在很大差距，提高胆红素的含量和纯度有利于提高人工牛黄的品质。此外，胆红素也是药典中100多种中成药制剂的主要成份，如扑热息痛片、银翘解毒丸等，市场需求量大，目前市场价格高达8万元/公斤。

目前，胆红素基本都是从动物胆汁中提取，但胆汁中天然胆红素含量相当低，如猪胆汁中的胆红素含量仅为0.05％左右，由于原料来源受到限制，所以国内开发活猪造瘘引流胆汁的技术，该技术虽然解决了胆汁来源的问题，但是虐待动物的问题引起很大的社会争议，应用受到限制。因此，开发非动物胆汁来源的胆红素生产方法具有重要经济价值和社会意义。

本发明以表达胆绿素还原酶的基因重组大肠杆菌细胞为生物催化剂，以胆绿素为底物生物转化合成胆红素(反应式见附图1)。富含胆红素的大肠杆菌菌体作为胆红素提取的原料，克服了从动物胆汁中提取胆红素原料来源不足的问题。

(三)发明内容

本发明提供一种生物转化法合成胆红素的方法，以表达胆绿素还原酶的大肠杆菌为催化剂，以胆绿素为底物，生物转化合成胆红素。该新方法解决了胆红素只能从动物胆汁中提取的问题，生产成本较提取法显著降低，且生产工艺具有高效、绿色环保等优点。

本发明采用的技术方案为：