[发明专利]一种表皮干细胞培养方法

权利要求书

1.一种表皮干细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将制备的表皮干细胞悬于表皮干细胞培养基中，加入到培养瓶中，将培养瓶置于培养箱中进行培养；

所述表皮干细胞的密度为1× 10⁴~2× 10⁵个/ml；

所述表皮干细胞培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；所述添加物各组分及浓度为：0.05~0.12mg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.1~0.4mg/L表皮生长因子、0.1~0.5mg/L维生素K、0.6~1mg/L氯化血红素、0.6~1.2mg/L亚麻酸、1~ 5 mg/L尼克酰胺、2~6mg/L精氨酸、2~8mg/L改性石墨烯、4~10mg/L铁皮石斛提取物、10~15mg/L谷氨酸、8~12mg/L天冬酰胺、5~20mg/L维生素C；

所述改性石墨烯的制备方法为：

S1、将石墨烯加入到混酸中，以500~800W超声处理35~60min；过滤，得到预处理石墨烯；

S2、将10~20份预处理石墨烯、4~8份氢氧化铝、2~6份碳酸氢铵加入到40~60份去离子水中，再加入0.5~1份3-巯丙基三甲氧基硅烷，加热至80~95℃，搅拌100~200min，得到混合料；

S3、将1~5份硬脂酸、4~10份N，N-二甲基甲酰胺加入到混合料中，降温至60~75℃，以500~800W超声处理40~60min，过滤，干燥，得到改性石墨烯；

所述的份均为重量份；

所述铁皮石斛提取物的制备方法为：

S11、将铁皮石斛粉碎至60~100目，得到铁皮石斛粉末；

S12、将铁皮石斛粉末加入到去离子水中，进行水蒸气蒸馏得到油水混合物，分离水相；

S13、将水相用5万道尔顿的超滤膜过滤水相；

S14、将过滤后的水相放入冷冻箱，快速冷冻，将冷冻箱温度快速降到-42~-36℃，启动真空泵，冻干箱抽真空到35~45Pa，在此温度和真空度下保持50~80min，调节冻干箱温度至-26~-18℃，真空度为30~35 Pa，保持50~80min；冻干箱温度升至-8~2℃，真空度调为25~35Pa，保持50~80min；再调节冻干箱温度为10~20℃，真空度调为20~25Pa，保持70~120min，最后，真空度恢复至大气压时结束冻干，即得铁皮石斛提取物。

2.根据权利要求1所述的表皮干细胞培养方法，其特征在于，所述培养瓶为T25培养瓶。

3.根据权利要求1所述的表皮干细胞培养方法，其特征在于，所述添加物各组分及浓度为：0.06~0.12mg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.15~0.4mg/L表皮生长因子、0.2~0.5mg/L维生素K、0.7~1mg/L氯化血红素、0.7~1.2mg/L亚麻酸、2~5 mg/L尼克酰胺、3~6mg/L精氨酸、3~8mg/L改性石墨烯、5~10mg/L铁皮石斛提取物、12~15mg/L谷氨酸、10~12mg/L天冬酰胺、8~20mg/L维生素C。

4.根据权利要求1所述的表皮干细胞培养方法，其特征在于，所述添加物各组分及浓度为：0.08mg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.25mg/L表皮生长因子、0.3mg/L维生素K、0.8mg/L氯化血红素、0.9mg/L亚麻酸、4 mg/L尼克酰胺、4.5mg/L精氨酸、6mg/L改性石墨烯、8mg/L铁皮石斛提取物、13mg/L谷氨酸、11mg/L天冬酰胺、15mg/L维生素C。

5.根据权利要求1所述的表皮干细胞培养方法，其特征在于，所述S1中石墨烯与混酸的重量比为1：（6~10）。

6.根据权利要求1所述的表皮干细胞培养方法，其特征在于，所述混酸由浓硫酸、浓硝酸按照重量比1：（0.5~2）配制而成。

7.根据权利要求1所述的表皮干细胞培养方法，其特征在于，所述S2搅拌速率为200~400rpm。

8.根据权利要求1所述的表皮干细胞培养方法，其特征在于，所述S12中去离子水与铁皮石斛粉末的重量比为（6~10）：1。