[发明专利]一种盐桦组织培养高效繁殖方法

说明书

本发明公开了一种盐桦组织培养高效繁殖方法。本发明以盐桦(Betula halophile)成年树的当年生的幼嫩茎节为外植体，通过外植体的消毒和不定芽诱导、不定芽继代增殖、壮苗培养、生根培养、试管苗移栽等等阶段，利用独特的培养基和培养方式，增殖倍数高达30以上，能在短期内获得大量的试管苗，有利于盐桦种质资源的保护和可持续利用。实施该发明只需有简单的植物组织培养设备即可进行。

技术领域：

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种盐桦组织培养高效繁殖方法。

背景技术：

盐桦(Betula halophile)是桦木科桦木属的多年生落叶小乔木或灌木，仅原生于新疆阿勒泰县，1999年分别被列为国家二级重点保护植物。2012年被列为国家极小种群野生植物。由于难以获得种子，扦插繁殖成活率低，利用植物组织培养技术能对其进行规模化繁殖。包括丛生芽再生体系和愈伤组织再生体系研究，但利用丛生芽再生体系能较好地保持母株的优良性状，变异小。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种盐桦组织培养高效繁殖方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种盐桦组织培养高效繁殖方法，包括以下步骤：

a.外植体的消毒和不定芽诱导：在生长季节选取盐桦(Betula halophile)成年树的当年生的幼嫩茎节为外植体，经消毒处理后，接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，培养形成不定芽；所述的不定芽诱导培养基每升含有：6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、萘乙酸0.1-0.3毫克、蔗糖20-30克、琼脂适量，其余为B5基本培养基(Gamborg et al,1968)，pH 5.8-6.0；

b.不定芽继代增殖：将诱导出的不定芽切割成单芽后接种到不定芽继代增殖培养基上进行不定芽的增殖，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天；所述的不定芽继代增殖培养基每升含有：6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、蔗糖20-30克、琼脂适量(琼脂6克)，其余为MS培养基，pH 5.8-6.0；

c.壮苗培养：将高2～3厘米芽接种到壮苗培养基上培养，培养温度24-28℃，光照度1800-2500lx，光照12-16小时/天；所述的壮苗培养基每升含有：IBA 0.5-1.5毫克、多效唑PP₃₃₃0.5-1.0毫克、蔗糖30-45克、琼脂适量(琼脂6克)，其余为MS培养基，pH 5.8-6.0；

d.生根培养：当芽高3～4厘米高时，切下接种到生根培养基上培养，培养温度24-28℃，光照度1800-2500lx，光照12-16小时/天，得到生根试管苗；所述的生根培养基每升含有：萘乙酸0.3-0.5毫克、蔗糖20-30克、琼脂适量(琼脂6克)，其余为1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；

e.试管苗移栽：当生根试管苗长至4～6厘米高时，在自然光照下炼苗7-10天，然后洗掉根部培养基，栽入栽培基质中培养，由此得到盐桦种苗。

所述的步骤b.不定芽继代增殖具体为：将诱导出的不定芽切割成单芽后接种到不定芽继代增殖培养基上进行不定芽的增殖，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，连续培养2次后，将每个芽切成带有两个茎节的茎段接种到不定芽继代增殖培养基上进行增殖，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天。

所述的消毒处理具体为先在体积分数75％酒精中浸泡10-30秒，再用质量分数0.1％升汞溶液连接消毒若干次，每次消毒后用无菌水冲洗4-6次。

所述的用质量分数0.1％升汞溶液连接消毒若干次具体为：用质量分数0.1％升汞溶液连续消毒3次，第一次消毒时间为4-6分钟，第二次消毒时间为3-5分钟，第三次消毒时间为1-3分钟。