[发明专利]一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种利用敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌发酵制备乙醇的方法，其特征在于，该菌株由原始酿酒酵母的Cln3基因失活后改造得到，所述Cln3基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述原始酿酒酵母来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1308，通过固定化发酵制备乙醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所用Cln3基因通过CRISPR-Cas9敲除。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酿酒酵母基因工程菌通过如下步骤构建得到：

（1）将Cas9质粒上gRNA scaffold序列上的靶位点改为基因Cln3的靶位点，得到修改后的质粒；

（2）提取菌株保藏编号为CICC 1308的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因组；

（3）以步骤（2）得到的基因组DNA为模板，在Cln3基因的靶向序列的上下游各设置长度为500bp的同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以Cln3基因的上游同源臂、下游同源臂为模板，通过重叠PCR扩增得到基因敲除片段；

（4）将步骤（1）和（3）得到的修改后质粒和基因敲除片段转化至原始酿酒酵母感受态中，即得Cln3基因失活的酿酒酵母基因工程菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30℃-40℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的发酵培养基配方如下：50-110g/L葡萄糖，3-6 g/L蛋白胨、0.3-0.6 g/L硫酸铵、2-5 g/L磷酸二氢钾、2-5 g/L酵母膏、0.3-0.6 g/L硫酸镁、0.01-1 g/L七水合硫酸亚铁、0.01-1g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。