[发明专利]一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母基因工程菌由原始酿酒酵母利用CRISPR‑Cas9技术敲除基因Cln3后改造而成，敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显增强，在固定化发酵中形成的生物被膜增多，增加了生物产量，缩短了发酵周期，提高了发酵效率。

技术领域

本发明属于基因工程及微生物技术领域，具体涉及一株利用CRISPR-Cas9技术敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

生物膜也称为生物被膜，是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，由微生物集群与其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜状结构附着于载体表面。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，更重要的是，生物膜还作为一种重要的工业应用——固定化发酵。与游离细胞发酵相比，固定化发酵中所形成的生物膜能在发酵过程中表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率。通常条件下，常规的游离细胞发酵50g葡萄糖大约需要8h左右，而固定化细胞只需要6h就可以将糖转化为乙醇，展现了固定化细胞出色的发酵效率和发酵能力。

成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，即CRISPR)II型系统是细菌免疫系统，现已被改造用于基因工程。CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内，CRISPR-Cas9技术风靡全球，成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株利用CRISPR-Cas9技术敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的应用。

发明思路：核细胞周期由一系列环素和激酶伙伴驱动，包括酵母中的G1环素Cln3。作为此级联的第一步，Cln3具有独特的定位，可以确定分部的关键增长率阈值。有数据表明(Michael Polymenis,Emmett V.Schmidt.Coupling of cell division to cell growthby translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast[J].Cold Spring HarborLaboratory Press,1997,11(19).)，Cln3的转化调控提供了一个机制耦合细胞生长和分裂。因此，本发明选取Cln3基因作为改造对象，构建酿酒酵母基因工程菌，以提高固定化发酵中生物被膜量，进而提高发酵效率和发酵能力。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母的Cln3基因失活。

其中，所述酿酒酵母来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1308。

其中，所述Cln3基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Cln3基因失活前的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将Cas9质粒上gRNA scaffold序列上的靶位点改为基因Cln3的靶位点，优选地，选用pCAS#60847基因靶位点可以是任何满足以下两点条件的约20nt的DNA序列，该序列在基因组中是特异存在的；靶位点紧邻着PAM(Protospacer Adjacent Motif)区并位于PAM区上游；