[发明专利]一种人体病菌培养毒株检测方法

权利要求书

1.一种人体病菌培养毒株检测方法，其特征在于，包括有以下步骤：

S1、对病菌进行无菌环境下的培养：通过一个无菌和无RNA酶的试管或者是培养基对病菌进行培养，然后向试管中添加流感培养溶液，或者在培养基中添加固定培养液，然后向试管中或者是培养基中添加流感病毒；

S2、在培养结束后对培养的病菌进行稀释取样：将试管或者是培养基中培养获得的病菌族群进行取样，然后将病菌添加进入到稀释试管中进行稀释，且稀释试管中添加有稀释溶液；

S3、将稀释试管中的病菌置于混合容器中进行快速的混合：将S2中的稀释试管密封置于旋转混合设备上进行充分的混合，且混合设备的转动保持在100-300r/min，混合时长为3-5min；

S4、在稀释过后，将稀释的病菌溶液置于离心机上进行离心：将S3中混合稀释过后的病菌溶液分成两份，一份稀释后的病菌溶液置于试管中进行离心处理，另一份在进行破壁之后再置于试管中进行离心处理；

S5、在离心处理过后对两组病菌溶液进行分别处理：将未破壁的病菌溶液取底层的细胞溶液10-20ul置于特福龙涂层的12孔显微镜载玻片的孔洞内，然后每组孔洞内依次添加10-20ul的流感特异性抗体和10-20ul的兔抗鼠荧光结合物，再加入0.1％伊纹氏蓝做负液，将破壁的病菌溶液提取上成溶液，置于PCR设备中进行核酸检测；

S6、通过两种检测方式，实现对病菌进行有效的检测，并且对比两种检测结果：将核酸检测结果和荧光检测结果进行对比，并且结合两种检测结果，判断病菌毒株的存在。

2.根据权利要求1所述的一种人体病菌培养毒株检测方法，其特征在于：所述S1中用于试管培养的流感培养液中的质量百分比含量溶剂包括有胰蛋白胨20.0％-22.0％；乳糖5.0％-5.5％；磷酸氢二钾2.70％-2.75％；磷酸二氢钾2.70％-2.75％；枸橼酸钠0.4％-0.5％；去氧胆酸钠0.04％-0.06％；水杨苷0.5％-0.6％；胆盐0.2％-0.4％；硫酸铝钾0.2％-0.3％；甘氨酸0.5％-0.6％；氯化钠5.0％-5.5％；十二烷基硫酸钠0.1％-0.2％；余量为蒸馏水，用于所述培养基培养的流感培养液除了包括有上述溶剂外还包括有琼脂。

3.根据权利要求1所述的一种人体病菌培养毒株检测方法，其特征在于：所述S2中的稀释溶液采用的是PBS溶液或者0.8-1.3％的氯化钠水溶液。

4.根据权利要求1所述的一种人体病菌培养毒株检测方法，其特征在于：所述S3中的稀释过程至少包括有三至六次，且所述稀释溶液的百分质量依次为0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％和1.3％。

5.根据权利要求1所述的一种人体病菌培养毒株检测方法，其特征在于：所述S4中的离心机的处理过程为在12000rpm转速下离心1-2min。

6.根据权利要求1所述的一种人体病菌培养毒株检测方法，其特征在于：所述S4中的破壁处理采用的是蛋白酶对病菌蛋白外壳进行处理，且蛋白酶的处理环境为PH在5-6.5，温度在35℃-40℃。

7.根据权利要求1所述的一种人体病菌培养毒株检测方法，其特征在于：所述S5中的载玻片在涂抹病菌溶液之后需要在干燥器内进行干燥，然后采用100％冰丙酮室温下10min固定载玻片。

8.根据权利要求1所述的一种人体病菌培养毒株检测方法，其特征在于：所述S5中的PCR设备检测需要添加乙型检测引物，所述乙型检测引物为GGG、ACA、TGA、AAG、ATG、TGT、CAG、CAT、TTA、TGG和AGC中的一种或者多种。

9.根据权利要求1所述的一种人体病菌培养毒株检测方法，其特征在于：所述S5中的PCR设备在转录之后的检测过程如下：将琼脂糖凝胶置于电泳槽内部，加入TBE Buffer，然后将PCR产物和Loading Buffer混合后加入到凝胶空中，稳压100V，电泳30-40min，最后使用凝胶成像系统观察结果。

10.根据权利要求1所述的一种人体病菌培养毒株检测方法，其特征在于：所述S6中的荧光检测结果分为阳性和阴性，所述阳性呈现苹果绿色荧光，所述阴性为深红色荧光。