[发明专利]一种利用数字PCR定量检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的方法在审
| 申请号： | 202110105703.0 | 申请日： | 2021-01-26 |
| 公开（公告）号： | CN112662745A | 公开（公告）日： | 2021-04-16 |
| 发明（设计）人： | 胡源;王卓;陈彦猛 | 申请（专利权）人： | 重庆医科大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司： | 重庆市前沿专利事务所(普通合伙) 50211 | 代理人： | 郭丽 |
| 地址： | 400016*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 利用 数字 pcr 定量 检测 乙型肝炎 病毒 共价 闭合 环状 dna 方法 | ||
1.一种利用数字PCR(ddPCR)定量检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提供待测样本；
(2)采用T5核酸外切酶处理待测样本；
(3)制备含有UNG-dUTP的ddPCR反应混合物；
(4)将处理后的待测样本加入含有UNG-dUTP的ddPCR反应混合物中进行UNG酶处理后，进行特异性扩增；
(5)采用ddPCR系统进行定量检测，
所述ddPCR反应混合物包括特异性扩增cccDNA的引物对和探针，所述引物对包括正向引物和反向引物，其序列分别如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示，所述探针序列如SEQID NO.:3所示。
2.根据权利要求1所述的一种利用ddPCR定量检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)采用T5核酸外切酶处理待测样本条件为：37℃下孵育1个小时，然后在70℃下孵育30min使所述T5核酸外切酶失活；所述T5核酸外切酶的作用剂量为5U/ug DNA。
3.根据权利要求1所述的一种利用ddPCR定量检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征在于，所述步骤(3)的反应混合物中每20μL反应混合物包括dUTP底物，正向引物、反向引物和探针浓度分别为900nM、900nM和250nM。
4.根据权利要求3所述的一种利用ddPCR定量检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征在于，所述步骤(3)的反应混合物中UNG酶的用量为每20μL反应混合物包括0.2U的UNG酶，处理条件为：在25℃下孵育30min。
5.根据权利要求1所述的一种利用ddPCR定量检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征在于，所述步骤(4)中ddPCR反应中特异性扩增的条件为：95℃×10min，40个循环的94℃×30s和60℃×1min。
6.根据权利要求1所述的一种利用ddPCR定量检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征在于，所述步骤(5)包括：采用QX200 Droplet Reader读板，并使用QuantaSoft Software进行分析。
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