[发明专利]一种利用数字PCR定量检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的方法

说明书

本发明公开一种利用数字PCR(ddPCR)定量检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)的方法，采用T5核酸外切酶处理待测样本；设计特异性扩增cccDNA的引物对和探针，所述引物对序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示，所述探针序列如SEQ ID NO.:3所示，利用ddPCR定量检测待测样本中HBV cccDNA。本发明提供的利用ddPCR定量检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法，能够实现对低水平HBV cccDNA的高灵敏度、高准确性定量检测。

技术领域

本发明属于病毒分子生物学检测技术领域，具体地，涉及一种利用数字PCR(ddPCR)检测乙型肝炎病毒的共价闭合环状DNA(cccDNA)的方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染呈世界范围广泛流行，会引起急性和慢性HBV肝炎。全球有超过2.4亿人是HBV慢性感染者，慢乙肝感染会导致肝硬化和肝细胞癌HCC。HBV是部分双链的DNA病毒，基因组大小为3.4kb。HBV特异性感染肝细胞后，病毒基因组的双链松弛环状DNA(rc-DNA)在细胞核中由宿主因子(如POLK，DNA连接酶LIG1/3)介导形成稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA)。HBV cccDNA是病毒的微小染色体，是所有HBV mRNA转录的模板，因此它是病毒持续感染的关键因素。此外，cccDNA清除被认为是完全治愈慢性乙型肝炎(CHB)的最有效策略。因此，在抗病毒治疗期间对慢性乙肝患者肝内cccDNA水平进行定量检测尤为重要。

但是定量检测肝内cccDNA的水平具有很高的难度和挑战性：首先，CHB患者肝细胞中cccDNA的拷贝数相对较低，据报道HBV cccDNA在感染肝细胞内的拷贝数平均为0.1-1.0拷贝/细胞，在隐匿性HBV感染甚至更低(中位数13个拷贝/10000个细胞)，因此需要高灵敏、特异、准确、绝对定量的检测方式。其次，区分cccDNA与rcDNA是准确检测cccDNA的主要障碍。目前，国内外用于检测HBV cccDNA的方法较多，例如经典的Southern blot、普通PCR、定量PCR和滚环扩增等。Southern blot被认为是cccDNA检测的金标准，但是操作复杂、耗时、半定量且不能进行高通量筛选，尤其是有时需要放射性标记探针，限制了其在临床样品测量中的应用。滚环扩增可以特异性扩增cccDNA，可用于cccDNA序列分析，但与Southernblot类似，滚环扩增不是绝对定量。普通PCR只能定性检测。实时荧光定量PCR(qPCR)通过针对HBV基因组两个直接重复区域(DR1和DR2)之间的缺口区域的引物设计，可实现绝对定量并且方便的检测方法，然而，通常会由于rcDNA污染而引起非特异性扩增；另外样品拷贝数低于50拷贝时结果不可靠。因此为避免rcDNA污染而导致的非特异扩增，qPCR检测时需要同时采用核酸酶如PSAD(Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase)，核酸外切酶III和T5核酸外切酶等消化rcDNA。

微滴数字PCR(ddPCR)是一种高灵敏度的定量检测方法，在传统PCR扩增前对样品进行微滴化处理，每个微滴含或者不含待检测核酸靶分子，PCR后检测荧光信号后，根据泊松分布原理和阳性微滴个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。ddPCR因其技术原理可实现低拷贝分子数的绝对定量，并且不依赖标准品和Ct值。最近，ddPCR结合PSAD(Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase)处理已用于准确定量临床样品中较低水平的cccDNA，但是研究发现，PSAD不能完全消化处理rcDNA。因此，在利用ddPCR准确定量检测临床样品中较低水平的cccDNA技术上，还需进一步探索与研究，其中核心的研究方向包括(1)如何完全消化处理rcDNA；(2)是否能将配合qPCR检测时所用的Exo III或T5核酸外切酶用于ddPCR系统；(3)ddPCR特异性扩增的引物、探针设计以及扩增条件的设计等。以上三个研究方向会对ddPCR是否能够定量检测临床样品中较低水平的cccDNA起决定性影响，而目前尚未有报道关于此方面的研究。

发明内容