[发明专利]一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其检测方法。该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示；检测方法为：(1)提取样品RNA，反转录得到cDNA备用；(2)以步骤(1)所得cDNA为模板，采用权利要求1所述引物对其进行PCR扩增，回收纯化扩增产物后，根据扩增结果判断是否含有鸡传染性支气管炎病毒。本发明能够同时检测Mass、QX、793B、TW、ck/CH/LSC/99I、TC07‑2这6种常见基因型IBV，鉴定方法快速高效，能够大规模检测，适于推广应用。

技术领域

本发明属于禽类病毒检测技术领域，具体涉及一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其检测方法，可用于检测我国目前主要流行的基因型鸡传染性支气管炎病毒。

背景技术

传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由冠状病毒科的传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病，以呼吸道症状、产蛋率和品质下降、肾脏病变等为特征。病鸡表现为咳嗽、喷嚏、发出气管啰音，幼鸡流鼻液，蛋鸡产蛋数量和质量下降，肉鸡食欲不振，肾型病鸡肾肿大、苍白，有大量尿酸盐沉积。各品种和年龄的鸡均易感，但主要侵害1～4周龄的幼鸡。

在鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)的检测和诊断中，由于其基因型种类多，不同基因型毒株之间全基因组序列差异较大(86％-98.8％)；在临床症状上与鸡新城疫、鸡传染性喉气管炎及鸡传染性鼻炎相似，所以IBV的实验室检测和诊断较为复杂困难。目前常规检测IBV的技术主要有病毒分离、血清学试验、病毒干扰试验和常规RT-PCR等,但这些方法在敏感性、特异性和时效性等方面都存在不足。常规RT-PCR方法以其简单、快捷的特点被用作IBV的实验室诊断方法，但该方法不能用于IBV的定量检测，并且对病毒含量很低的病料也不能够很好地检出。现阶段存在一些针对特定基因型IBV的荧光定量检测方法，其局限在于不能测定其它流行基因型IBV毒株。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其检测方法，本发明能够同时检测目前主要流行基因型鸡传染性支气管炎病毒，主要是针对Mass、QX、793B、TW、ck/CH/LSC/99I、TC07-2这6种常见IBV基因型病毒，鉴定方法快速高效，能够大规模检测，适于推广应用。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的引物对，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。

进一步地，引物对用于扩增鸡传染性支气管炎病毒的保守区域1ab，检测对象为全长的病毒基因组核酸而不是亚基因组核酸。

进一步地，鸡传染性支气管炎病毒为我国目前主要流行基因型鸡传染性支气管炎病毒，其包括Mass、QX、793B、TW、ck/CH/LSC/99I、TC07-2基因型中的至少一种。

一种同时检测多种鸡传染性支气管炎病毒的方法，包括以下步骤：

(1)提取样品RNA，反转录得到cDNA备用；

(2)以步骤(1)所得cDNA为模板，采用权利要求1所述引物对其进行PCR扩增，回收纯化扩增产物后，根据扩增结果判断是否含有鸡传染性支气管炎病毒。

进一步地，PCR扩增体系为：TB Green 10μL、DNA模板1μL、SEQ ID NO.1和2所示引物各0.8μL，最后用ddH₂O补足至20μL。

进一步地，PCR扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s；58℃退火20s；72℃延伸25s，共40个循环。