[发明专利]微卫星不稳定性检测方法、标志物组合、试剂盒及应用

权利要求书

1.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有下表所示91个微卫星位点标志物组合的检测试剂：

。

2.权利要求1所述试剂盒的非疾病诊断治疗目的的用途，其特征在于，用于微卫星不稳定性检测。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，用于组织DNA样本或液体活检DNA样本的微卫星不稳定性检测。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于微卫星不稳定性检测，所述微卫星不稳定性检测的结果用于辅助评估泛癌实体瘤患者的错配修复状态、免疫治疗疗效及预后分层。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述泛癌实体瘤包括鼻咽癌、肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、结直肠癌、胆管癌、前列腺癌、上尿路尿路上皮癌和膀胱尿路上皮癌中的一种或多种。

6.微卫星位点标志物组合的筛选方法，其特征在于，步骤包括：

1）估算所需最小的阳性样本量和阴性样本量；

2）对样本中与癌症相关的所有基因的靶区域进行二代测序；

3）对步骤2）测序所得原始数据进行序列比对、去重、质量分数重校准，统计每个微卫星位点的测序深度；

4）从阴性样本集中筛选出平均测序深度大于20的微卫星位点，从阳性样本集中筛选出平均测序深度大于50的微卫星位点；

5）对步骤4）筛选出的微卫星位点，统计每个等位基因在阳性样本集和阴性样本集中的测序总深度和发生频率，并计算每个等位基因在两个样本集间的频率变化倍数；所述频率变化倍数小于1且在阴性样本集中的发生频率大于1%的等位基因为稳定型等位基因，所述频率变化倍数大于20且在阳性样本集中的发生频率大于1%的等位基因为不稳定型等位基因；所述发生频率同时高于比其核苷酸重复单元的重复次数少一次和多一次的两个等位基因的发生频率的等位基因为该微卫星位点在相应样本集中的相对优势基因型；同时在阳性样本集和阴性样本集中被选为相对优势基因型的等位基因为该微卫星位点的绝对优势基因型；

6）预筛选微卫星位点标志物：

61）筛选出至少有一个稳定型等位基因和一个不稳定型等位基因的微卫星位点；

62）筛选出相对测序深度在10%以上的微卫星位点；

63）筛选出在阳性样本集中超过50%以上的样本中均有检出的微卫星位点；

64）筛选出有且只有一个绝对优势基因型的位点；

65）筛选出不稳定型等位基因在阴性样本集中的发生频率小于0.5%的位点；

66）筛选出不稳定型等位基因在阳性样本集中的发生频率大于10%的位点；

7）使用超几何分布检验，对步骤6）预筛选出的微卫星位点分别进行稳定性评价；

超几何分布P统计值的计算公式为：

其中：

N为所有阴性样本在微卫星位点的总体测序深度；

M为所有阴性样本在不稳定型等位基因区的总体测序深度；

n为待评价样本在微卫星位点的测序深度；

k为待评价样本在不稳定型等位基因区的测序深度；

对超几何分布的P统计值进行多重检验校正，获得校正后的q统计值，计算该微卫星位点在待评估样本中的稳定性评分MSlocus_Msscore，计算公式为：

，其中：

evaluable(P)为待评价样本中所有可评价微卫星位点的总个数；

rank(P)为该微卫星位点在待评价样本中所有可评价微卫星位点的P统计值从小到大排序列表中的排名；

若MSlocus_MSscore3，则该微卫星位点在待评估样本中的状态为不稳定型；若MSlocus_MSscore≤3，则该微卫星位点在待评估样本中的状态为稳定型；

8）删除在阴性样本集中反复被判定为不稳定型的位点，最终筛选出的多个微卫星位点即为微卫星位点标志物组合。