[发明专利]微卫星不稳定性检测方法、标志物组合、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一组微卫星位点标志物、含有该微卫星位点标志物组合的试剂盒，以及所述微卫星位点标志物组合和所述试剂盒的用途。本发明还公开了所述微卫星位点标志物组合的筛选方法以及利用该微卫星位点标志物组合对待测样本进行微卫星不稳定性检测的方法。本发明利用二代测序技术筛选出可以明显区分微卫星稳定性状态的微卫星位点标志物组合，并用其评估泛癌实体瘤患者的组织或液体活检DNA样本的微卫星稳定性状态，在保证检测灵敏度和特异性的前提下，扩大了检测范围，实现了对患者疾病状态的动态监控，以及对患者治疗响应状态和预后风险的实时评估。

技术领域

本发明涉及基因测序领域，特别是涉及微卫星不稳定性检测。

背景技术

根据2019年《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》（以下简称《共识》）的定义：“微卫星（Microsatellite，MS）是指真核细胞基因组中以少数几个核苷酸（多为1-6个）为单位串联重复（重复次数一般为5-50次，少数情况下可达70次）的DNA序列，又称为短串联重复（Short tandem repeats，STR）。”这类DNA序列经常发生核苷酸重复单元的插入或缺失而导致微卫星序列的整体长度变化，从而表现出比其他基因组区域更高的突变率和多态性。在整个人类基因组中，广泛分布着超过3000000个单核苷酸重复微卫星，二、三、四、五核苷酸重复微卫星的数目比之较少。它们大部分出现在不直接参与蛋白质合成的非编码区域，因而较少受到进化选择的影响，可以作为DNA指纹和个体鉴别的遗传标记；而少数存在于基因内含子、侧翼调控区域，甚至是编码区域的微卫星，其变异则可能引起基因表达的变化并引发疾病。微卫星长度的高度可变性，目前普遍认为可能是由于在真核细胞减数分裂复制过程中发生的DNA聚合酶滑移而引起，这种错误通常会被DNA错配修复（DNA mismatch repair，MMR）体系发现并予以校正。但当DNA错配修复功能也发生缺陷（Deficient MMR，dMMR）时（如在一部分肿瘤细胞中），微卫星出现的复制错误得不到纠正并不断累积，使得微卫星序列长度或碱基组成发生改变，即称为发生了微卫星不稳定性（Microsatellite instability，MSI），同时导致基因组呈现高突变表型。

《共识》指出：“MSI根据程度可以被分成3类：微卫星高度不稳定性（MSI-high，MSI-H）、微卫星低度不稳定性（MSI-low，MSI-L）、微卫星稳定（Microsatellite stability，MSS）。” MSI-H在不同实体瘤类型中的发生率存在较大差异，目前已知MSI-H发生率较高的实体瘤包括：子宫内膜癌（20-30%）、胃腺癌（15-20%）、结直肠癌（12-15%）等。另外，在许多遗传性肿瘤综合症中有着极高的微卫星不稳定性发生率，如Lynch综合征（Lynch syndrome，LS）患者中的90%都会表现出MSI-H性状。目前已有多项证据表明，MSI-L与MSS癌症患者的微卫星变异分布与频率大体相似，在对治疗的响应中也倾向于被认为是同一种分子亚型，而MSI-H患者则具有明显不同的响应机制和预后差异。例如，近年来成为抗肿瘤治疗领域热点的免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1和CTLA-4单克隆抗体类药物，就在MSI-H/dMMR患者中有着很好的客观应答率（30-80%），而在MSI-L/MSS患者中则鲜有疗效。因此检测和评估癌症患者的微卫星稳定性状态将有助于对患者人群进行精细分层，进而辅助临床医生选择更精准的治疗方案，具有十分重要的临床意义。

常用的微卫星检测方法包括：直接检测MS位点的多重荧光PCR结合毛细管电泳法、检测MMR蛋白表达的免疫组织化学方法（Immunohistochemistry，IHC）、基于二代测序（Nextgeneration sequencing，NGS）的MSI算法等。