[发明专利]一种基于UPLC-MS/MS的血浆心血管疾病相关生物标志物靶向代谢组学定量方法

权利要求书

1.一种基于UPLC-MS/MS的血浆心血管疾病相关生物标志物靶向代谢组学定量方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)标准品准备

(1.1)将标准品和内标IS分别溶解在第一溶剂中，分别得到标准储备液和IS储备液；

(1.2)梯度稀释所述标准储备液，所述梯度稀释的比例为1-1/400；

(1.3)标准品质控品选取：选取标准储备液进行无稀释、1/20稀释和1/100稀释后定义为高浓度质控品、中浓度质控品、低浓度质控品；

(2)样本制备

血浆样品制备：

(a)取血浆样品于EP管中，加入内标IS和甲醇/水溶液；然后，加入蛋白沉淀剂进行蛋白质沉淀；然后低速涡旋后，再高速低温离心；

(b)将所述步骤(a)离心后的上清液转移并离心浓缩；

(c)将所述步骤(b)浓缩后的残余物重新溶解于第二溶剂中；然后低速涡旋混匀后，高速低温离心；然后分离上清液，并用孔板过滤器进行过滤；

高浓度质控品、中浓度质控品、低浓度质控品和标准工作校准样品制备：按照所述步骤(a)-(c)进行制备；

空白对照样品制备：所述空白对照样品中仅用超纯水替代所述血浆，用所述IS储备液替代所述甲醇/水溶液，按照所述步骤(a)-(c)进行制备；

(3)UPLC-MS/MS分析。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1.1)中，所述第一溶剂为甲醇和/或水；所述标准储备液的浓度为1mg/mL；所述标准品为L-组氨酸、L-赖氨酸、琥珀酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、三甲胺-氮氧化物、甜菜碱、肉碱、氯化胆碱、2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、吲哚-3-乙酸、吲哚丙烯酸、吲哚-3-丙酸、泛酸、苯乙酰谷氨酰胺、苯丙氨酸、苯基乳酸、苯基丙酮酸；所述IS储备液的浓度为1mg/mL；所述内标IS为稳定同位素标记的内标物，包含三甲胺-d9-氧化物、3-羟基丁酸-d4钠盐、L-赖氨酸-4，4，5，5-d4盐酸盐、D-苯丙氨酸-d7、吲哚-2，4，5，6，7-d5-3-乙酸酯、L-酪氨酸-13C9，15N、L-色氨酸-d5、苯乙酰-D5-L-谷氨酰胺、氯化胆碱-d9、琥珀酸-2，2，3，3-d4。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1.2)中，所述梯度稀释的比例为1，1/2，1/4，1/10，1/20，1/40，1/100，1/200和1/400。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述血浆样本取量为50-150μL；所述内标取量为5-15μL；所述内标IS为稳定同位素标记的内标物，包含三甲胺-d9-氧化物、3-羟基丁酸-d4钠盐、L-赖氨酸-4，4，5，5-d4盐酸盐、D-苯丙氨酸-d7、吲哚-2，4，5，6，7-d5-3-乙酸酯、L-酪氨酸-13C9，15N、L-色氨酸-d5、苯乙酰-D5-L-谷氨酰胺、氯化胆碱-d9、琥珀酸-2，2，3，3-d4。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述甲醇/水溶液的体积为10-30μL；所述蛋白沉淀剂为乙腈和/或甲醇；所述蛋白沉淀剂的体积为300-500μL；所述低速为转速2000-3000rpm；所述涡旋的时间为3-10min；所述高速为转速10000-12000rpm；所述低温为4-10℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述浓缩的时间为1-3h。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述第二溶剂为乙腈/水，甲醇/水；所述第二溶剂的体积为100-300μL；所述高速为转速10000-12000rpm；所述低温为4-10℃；所述低速为转速2000-3000rpm。