[发明专利]一种基于UPLC-MS/MS的血浆心血管疾病相关生物标志物靶向代谢组学定量方法

说明书

本发明属于生物分析领域，涉及一种基于UPLC‑MS/MS灵敏可靠的血浆心血管疾病相关生物标志物靶向代谢组学定量方法。通过优化质谱参数和液相色谱方法，实现了在16min内一次进样，对20种包括芳香族氨基酸分解代谢、氧化三甲胺生物合成和组氨酸代谢等途径代谢的生物标志物进行高通量、高灵敏、高分离度的检测。该方法线性良好，线性相关系数均大于0.99，日内精密度和日间精密度分别为1.12～14.12％和0.30～13.74％，回收率和稳定性也能满足生物样品的分析要求。这种靶向代谢组学方法已被证明具有对代谢标志物进行准确分析的强大能力，为大规模的生物标志物验证提供了有价值的信息，是阐明其潜在的心血管疾病的物质基础，为临床诊断或早期预警提供有力的支持。

技术领域

本发明属于生物分析领域，涉及一种基于UPLC-MS/MS的血浆心血管疾病相关生物标志物靶向代谢组学定量方法。

背景技术

心血管疾病(CVD)已成为世界范围内的主要死亡原因和严重的公共卫生挑战。根据世界卫生组织的数据，2016年因心血管疾病死亡的人数已达1790万。如果没有早期预防和干预策略，心血管疾病的患病率将持续增加。由氧化低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的沉积和逐渐积累产生的动脉粥样硬化是CVD的主要原因。然而，其潜在的发病机制尚未完全阐明，这阻碍了CVD的早期预警和有效的风险评估。探究这种复杂疾病的病理生理学基础是诊断动脉粥样硬化性脑血管病的迫切需求，而挖掘疾病相关的敏感、特异和可靠的生物标志物是一种研究途径。

代谢组学作为一种新兴的“组学”策略，被用来描述疾病或异常条件下生物系统中小分子代谢物的变化，已广泛应用于疾病候选生物标志物鉴定、病理机制研究、临床药物发现和评价等领域。近年来，许多基于代谢组学的生物标志物鉴定和病理生理机制探索已越来越多地应用于心血管疾病。几项代谢组学研究表明，血浆TMAO是心血管风险的新标志，具有促动脉粥样硬化作用，其生物合成前体如肉碱、胆碱、甜菜碱、三甲基赖氨酸和γ-丁内酯也可以是CVD的独立危险因素。此外，芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)及其微生物代谢产物也显示出与心血管疾病密切相关，与其在免疫调节中的关键作用相对应。

非靶向代谢组技术和靶向代谢组技术是代谢组学研究的主要方法。非靶向代谢组可以提供生物样品更全面更丰富的代谢组分信息，存在峰对齐、峰识别误差、鉴定假阳性率高、不同仪器间结果难以重现、对于低丰度的痕量物质难检出等缺点。而靶向代谢组学也称为定量代谢组学，可以准确地定量复杂生物样品中与特定代谢途径或组分的相关代谢物，相比非靶向代谢组，灵敏度及准确度更高。因此，建立一种高灵敏度、高覆盖率的靶向代谢组学分析方法，对于准确评估内源性代谢物，尤其是关键的微量代谢物具有重要意义。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)结合多反应监测(MRM)可为潜在生物标志物的验证和定量提供更高的灵敏度和选择性。LC-MS/MS技术已被用来证明心血管疾病与某些代谢物(如缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)之间的联系，但没有报告验证所用方法的准确性和重现性，但这些方法学的内容无疑对获得毋庸置疑的结果至关重要，另外相关的代谢标志物也不全面，没有已报道的方法将所有相关的标志物都涵盖进去的高通量定量方法。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述问题，本发明建立了一种灵敏可靠的液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)，用于同时定量心血管疾病生物标志物，包括TMAO、肉碱、琥珀酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等20种，并验证了该方法的准确性、精密度、线性、稳定性和提取回收率等性能，从而确保该定量方法的准确性及可靠性。该方法有望提供生物标志物的精确定量结果，从而对心血管疾病的病理机制有更深入的了解。

本发明提供了一种基于UPLC-MS/MS的血浆心血管疾病相关生物标志物靶向代谢组学定量方法，所述方法包括以下步骤：

(1)标准品准备

(1.1)将标准品和内标(IS)分别溶解在第一溶剂中，分别得到标准储备液和IS储备液；

(1.2)梯度稀释所述标准储备液，梯度稀释的比例为1-1/400；