[发明专利]一种快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌的方法

权利要求书

1.一种快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取褐飞虱肠道DNA或脂肪体DNA；

2)以引物ITS3F-ITS4R通过菌落PCR扩增酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ITS2序列；利用步骤1)所得DNA，以ActinF-ActinR为引物扩增褐飞虱β-Actin序列，PCR产物纯化后连接到载体pMD19-T上，然后转化到JM109感受态细胞中；

其中，引物序列如下：

ITS3F：5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’；

ITS4R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；

ActinF：5’-GATGAGGCGCAGTCAAAGAG-3’；

ActinR：5’-GTCATCTTCTCACGGTTGGC-3’；

转化完成后，分别以引物ITS3F-ITS4R和ActinF-ActinR进行菌落PCR确认产物片段和插入片段一致；确认一致后挑取阳性克隆于液体LB培养基中培养，所得菌液提取质粒DNA，用于测序以及制备标准品；

3)根据质粒浓度与质粒bp数计算质粒拷贝数，将选定浓度梯度的质粒进行实时荧光PCR扩增，然后根据拷贝数和Ct值制作酿酒酵母ITS标准曲线和褐飞虱β-actin质粒标准曲线；

4)将待定量检测的样品DNA稀释设定倍数后分别以ITS3F-ITS4R和ActinF-ActinR为定量引物进行荧光定量检测；以褐飞虱肠道真菌ITS拷贝数与褐飞虱虫体β-Actin的拷贝数的比值来表示单位虫体肠道内共生真菌的数量，以褐飞虱脂肪体真菌ITS拷贝数与褐飞虱虫体β-Actin的拷贝数的比值来表示单位虫体脂肪体内共生真菌的数量。

2.如权利要求1所述的快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌的方法，其特征在于，所述步骤1)中，提取褐飞虱肠道DNA包括如下步骤：

1.1)采用医用解剖镊去除褐飞虱头部，将褐飞虱胸腹部缓慢分离保证肠道完整，取出肠道后在无菌PBS缓冲液中洗涤后放入已经加入PBS缓冲液的离心管内；

1.2)取步骤1.1)所得样品，离心并去除上清，研磨样品，加入lyticase，再加入Proteinase K，混匀，进行金属浴消化；

所得样品加入等体积DNA提取液，颠倒混匀静置，离心；所得的上清液转移至新的离心管内，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，离心并去除上清；加入75％乙醇漂洗DNA沉淀，离心并去除上清，通风橱内开盖倒置在吸水纸上；加入灭菌超纯水，37℃金属浴溶解；所得DNA样品稀释作为荧光定量PCR模板。

3.如权利要求1所述的快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌的方法，其特征在于，所述步骤1)中，提取褐飞虱脂肪体DNA包括如下步骤：

1.1)采用医用解剖镊去除褐飞虱头部，将褐飞虱胸腹部分离保证肠道完整，取出肠道后将剩余部分在无菌PBS缓冲液中洗涤，后放入PBS缓冲液内，去除褐飞虱剩余腹部其他器官，在载玻片上滴加PBS缓冲液，反复挤压褐飞虱腹部得到脂肪体与PBS的混合液，吸入无菌离心管内；

1.2)取步骤1.1)所得样品，离心并去除上清，研磨样品，加入lyticase，再加入Proteinase K，混匀，进行金属浴消化；

所得样品加入等体积DNA提取液，颠倒混匀静置，离心；所得的上清液转移至新的离心管内，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，离心并去除上清；加入75％乙醇漂洗DNA沉淀，离心并去除上清，通风橱内开盖倒置在吸水纸上；加入灭菌超纯水，37℃金属浴溶解；所得DNA样品稀释作为荧光定量PCR模板。

4.如权利要求1所述的快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所得菌液提取质粒DNA采用SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit试剂盒。