[发明专利]一种快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌的方法，针对目前褐飞虱共生真菌定量检测方法存在的不足。本发明利用含有酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae ITS序列和褐飞虱肌动蛋白β‑actin序列的质粒分别构建标准曲线,建立了通用的荧光定量PCR反应检测体系,检测了单位虫体的褐飞虱肠道或脂肪体内共生真菌总数量。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌检测技术。

背景技术

褐飞虱(Nilaparvata lugens)属半翅目飞虱科(Homoptera:Delphacidae)，是一种只以水稻或野生稻为食的迁飞性害虫，是亚洲稻区的重要害虫。化学农药能有效控制褐飞虱的发生，但长期以来大量、频繁地使用单一化学杀虫剂，不仅严重污染了环境，同时也不可避免地造成了褐飞虱对化学杀虫剂产生抗药性。研究证实，褐飞虱的抗药性发展与其体内种类繁多的共生菌有着密不可分的关系。褐飞虱肠道和脂肪体内存在大量共生真菌，这些共生真菌与褐飞虱相互依存相互影响，褐飞虱为共生菌提供了适宜的生存环境，共生菌对褐飞虱的生长、发育、营养代谢、抗性变异以及免疫功能等具有重要的作用，缺失共生菌会直接导致褐飞虱生长、发育延缓，繁殖能力丧失，以及过早死亡。

目前共生真菌检测主要有高通量测序、血细胞计数以及荧光定量PCR等方法。共生真菌主要以18S rDNA、ITS序列进行扩增子测序分析，但是检测的结果只能体现某类或某种共生菌在宿主体内的相对丰度变化，并不能比较处理前后该类菌或该种菌绝对量的变化。血细胞计数法简捷、直观，但是由于计数室中只能容纳0.1ml的样品，而褐飞虱个体间差异相差较大，因此取样量少有时实验结果并不能反映真实情况。发明以褐飞虱体内共生真菌ITS序列拷贝数与虫体β-actin基因拷贝数作比，排除褐飞虱总RNA提取过程中产生的误差，更加精准检测褐飞虱肠道和脂肪体内真实的共生真菌数量。

发明内容

本发明利用荧光定量PCR法建立了一种褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌快速检测方法，并可用于不同处理条件下的数量测定。

本发明的目的是为褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌数量测定提供一项新技术。本发明的另一目的是提供该快速检测方法在不同处理条件下褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌数量测定的应用，为后续研究褐飞虱和共生菌间的关系奠定基础。

本发明提供了一种快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生真菌的方法，其包括如下步骤：

1)提取褐飞虱肠道或脂肪体DNA；

2)以引物ITS3F-ITS4R通过菌落PCR扩增酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ITS2序列；利用步骤1)所得DNA，以ActinF-ActinR为引物扩增褐飞虱β-Actin序列，PCR产物纯化后连接到载体pMD19-T上，然后转化到JM109感受态细胞中；

其中，引物序列如下：

ITS3F：5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’；

ITS4R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；

ActinF：5’-GATGAGGCGCAGTCAAAGAG-3’；

ActinR：5’-GTCATCTTCTCACGGTTGGC-3’；

转化完成后，分别以引物ITS3F-ITS4R和ActinF-ActinR进行菌落PCR确认产物片段和插入片段一致；确认一致后挑取阳性克隆于液体LB培养基中培养，所得菌液提取质粒DNA，用于测序以及制备标准品；

3)根据质粒浓度与质粒bp数计算质粒拷贝数，将选定浓度梯度的质粒进行实时荧光PCR扩增，然后根据拷贝数和Ct值制作酿酒酵母ITS标准曲线和褐飞虱β-actin质粒标准曲线；