[发明专利]一种表达细胞因子组合物的NK滋养层细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种表达细胞因子组合物的NK滋养层细胞及其制备方法和应用，所述NK滋养层细胞表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L；所述CD19包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述CD86包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明构建的NK滋养层细胞对CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L的表达率高，各因子协同激活NK细胞的增殖能力，实现了体外诱导NK细胞分化成熟的效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种表达细胞因子组合物的NK滋养层细胞及其制备方法和应用。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是重要的免疫细胞，不仅是机体抵抗癌细胞和病毒感染的第一道防线，而且具有免疫调节功能。临床研究发现，NK细胞过继性免疫治疗恶性肿瘤具有良好的应用前景。

现有的NK细胞培养方法主要包括因子诱导法、抗体包被法、专用NK培养基培养法和干细胞诱导法等。其中，因子诱导法为将外周血单个核细胞(PBMC)中的NK细胞培养于普通淋巴细胞培养基中，并加入细胞因子和/或饲养层细胞；抗体包被法是在抗体包被的培养瓶中用普通淋巴细胞培养基扩增培养PBMC或分选后的NK细胞；专用NK培养基培养法是采用专用的NK培养基从PBMC中特异性扩增NK细胞或分选后的NK细胞；干细胞诱导是将干细胞诱导分化成NK细胞，并进行扩增。

CN109628398A公开了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，构建表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞，所述表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞经过冷冻干燥。该方法将饲养层细胞冷冻干燥后既保留了工程细胞作为饲养层细胞的刺激作用，又降低了细胞在灭活及保存过程中的成本，降低了实验室及临床使用中的成本并提高了其可使用的便利性，在12～21天的时间获得可满足临床治疗数量的NK细胞，细胞活力高，对K562及A549都有较高的杀伤效果。然而扩增和活化效率有待于进一步提高。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种表达细胞因子组合物的NK滋养层细胞及其制备方法和应用，所述NK滋养层细胞表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L，各因子协同激活NK细胞的增殖和杀伤功能，提高了NK细胞的扩增效率和体外分化成熟能力。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种NK滋养层细胞，所述NK滋养层细胞表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L。

本发明中，膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L协同激活NK细胞的增殖能力，并使NK细胞长期稳定保持高效的扩增效率和显著的杀伤功能，实现了体外诱导NK细胞分化成熟的效果。

优选地，所述CD19包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHL。

优选地，所述CD86包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：