[发明专利]利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法

权利要求书

1.利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，其特征在于：通过利用目标基因测序技术检测中国广西壮族儿童原发性肾病综合征TRPC6基因致病突变的方法，包括如下步骤：

1)研究对象的选择：选自诊断符合儿童原发性肾病综合征诊断标准，且排除肾小球肾炎、继发性肾病综合征的患儿，空腹抽取患儿外周静脉血2mL，EDTA抗凝；

2)基因组DNA的提取：将收集肾病综合征患儿静脉血标本，用DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，然后使用Invitrogen Qbit分光光度计通过计算260nm处的吸光度与280nm处的吸光度的比率来测试DNA纯度；

3)FastTarget目标区域测序：

针对TRPC6目标区域设计高质量的测序引物，挑选能够以标准人基因组为模板，扩增获得清晰单一条带的引物，按每个panel 20对引物的标准，将优化后的引物混合为多重PCR引物panel，以标准人基因组为模板进行扩增；

基于毛细管电泳的特殊方法，最终获得的优化panel数量为引物数的二十分之一；

利用带有Index序列的引物，通过PCR扩增向文库末端引入和illumina平台兼容的特异性标签序列，反应采用11个循环数的PCR程序，降低PCR的倾向性；

将所有样品Index PCR扩增产物等量混合，并经割胶回收获得最终的FastTarget测序文库，文库的片段长度分布经Agilent 2100Bioanalyzer验证，文库摩尔浓度精确定量后，最终于Illumina Miseq平台，以2×150bp/2×250bp的双端测序模式进行高通量测序，获得FastQ数据；

4)数据筛选和生物学信息分析：

使用BWA软件，将每个样本的原始数据与参考基因组UCSC hg19比对，使用GATK标准程序校正BWA软件得到的初步比对结果，分别采用VarScan软件和GATK HaplotypeCaller方法这两种方式检测每个样品的SNV/InDel，并按照软件推荐的筛选方案进行过滤，对比上述两种检测方案找到的SNV/InDel，合并所有的样品，通过ANNOVAR将所有的SNV/InDel位与数据库进行比对分析，评估这些SNV/InDel位点的变异频率、功能特征、保守性、致病性，快速地找到最有生物学意义的SNV/InDel位点；

5)血清TRPC6水平的测定：采用双抗体夹心ELISA法检测样本中目的蛋白浓度，按试剂盒说明书操作；

6)统计学分析：

寻找与疾病相关的位点，使用关联分析方法，根据已有样本的突变位点的基因型数据以及表型数据，采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，plink分析软件进行关联分析、Haploview软件进行连锁不平衡分析；

使用数学工具如逻辑回归、卡方、秩和检验进行统计分析：

患病组和健康组TRPC6基因型及其等位基因用计数法计算频率，并进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验；

逻辑回归以单个位点为单位，按5个假设的遗传模型：Dominant频率低的allele为显性，Recessive频率低的allele为隐性，Log-additive叠加作用，HOM/HET共显性模型，以纯合正常为参照进行关联分析；卡方分析同样对每个位点进行分析，并设4个分析模型，Codominant共显性、Dominant显性、Recessive隐性、Allele等位基因。

2.根据权利要求1所述的利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，其特征在于：步骤1)所述的继发性肾病综合征，是指乙肝、系统性红斑狼疮、紫癜、药物引起的继发性肾病综合征。

3.根据权利要求1所述的利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，其特征在于：步骤2)所述的DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒，来自德国Qiagen公司。

4.根据权利要求1所述的利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，其特征在于：步骤4)所述的数据库，是指dbSNP数据库、千人基因组、dbSNP数据库、千人基因组、ESP6500、ExAC03、ExAC03_EAS、gnomAD、Hrcr1Kaviar_20150923数据库。

5.根据权利要求1所述的利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，其特征在于：步骤6)所述的基因型数据以及表型数据，是指case/control数据、性别、年龄。