[发明专利]利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法

说明书

本发明公开了利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，应用二代测序技术对表现原发性肾病综合征的患儿进行TRPC6基因的基因测序，并进行相关的生物信息学分析。设计TRPC6的13个外显子区域特异性捕获探针，与基因组DNA文库进行杂交，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后，再利用illumina Nextseq第二代测序仪进行测序，并与正常壮族儿童进行对比，通过数据分析确定突变位点。经过数据分析，发现2号外显子上的c.172CT(p.R58W)杂合突变，可导致相关蛋白表达和功能异常，考虑为中国广西壮族儿童致病突变。

【技术领域】

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，尤其涉及利用目标基因测序技术检测中国广西壮族儿童原发性肾病综合征TRPC6基因致病突变的方法。

【背景技术】

肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)是由于肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增高、大量血浆蛋白从尿中丢失而导致一系列病理生理改变的一种临床综合征。儿童原发性肾病综合征(primary nephritic syndrome，PNS)是一类严重影响患儿正常生长发育的免疫介导的肾小球疾病，对儿童生命健康以及生活质量造成了严重的影响。肾脏致病基因的研究已成为行业的热点，筛选PNS的发生发展中起关键作用的基因，并给予特异性干预，对于治疗PNS具有重要意义。TRPC6基因定位于11号染色体的长臂21区到22区(11q21-q22)，含13个外显子，人类的该基因突变可表现常染色体显性遗传的家族性局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomurular sclerosis，FSGS)。TRPC是瞬时受体电位(transientreceptor potential，TRP)家族主要成员之一，TRP包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPP、TRPN及TRPML 6个蛋白家族成员，每个成员又有许多亚型，除TRPN外，其他成员在人类均有表达。TRPC包括7个亚族，即TRPC1、2、3、4、5、6、7，TRPC6与TRPC3、7氨基酸序列的相似度高达90％，TRPC通道在人体广泛表达，包括神经系统、血液系统、平滑肌、卵巢、肺、脾、肾等人体重要脏器。瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient channel receptor potential cation 6,TRPC6)是由TRPC6基因编码的一种裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)蛋白，SD由相邻的足细胞足突有规律地相互交错形成，为肾小球滤过屏障的重要组成部分，在维持肾小球滤过膜的完整性中起重要作用。多因素作用导致肾小球足细胞损伤引起SD的足突融合是肾脏疾病最主要的形态学改变。TRPC6于肾脏组织表达甚广，肾小球足细胞、系膜细胞、内皮细胞以及肾小管间质血管壁、上皮细胞均有表达，也表达于肾脏血管，且在足细胞的表达最重要，于足细胞接近SD的初级突起表达最强。

传统的Sanger测序法测序通量较低，难以满足测序需求，需要高通量的方法来进行致病基因的检测。新发展起来的二代测序和生物信息分析技术，较以往的方法更加快捷、通量更高。目标基因捕获联合二代测序技术是近几年发展起来的快速、高通量的测序方法，可以对多个基因同时进行测序，成本也比全外显子测序低。

综上所述，研究TRPC6的致病突变和新突变，对于壮族儿童原发性肾病综合征分子病因学有更好的认识。

【发明内容】

针对现有技术中传统的Sanger测序法测序通量较低，难以满足测序需求，需要高通量的方法来进行致病基因的检测的不足，本发明提供了利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，具体是通过利用目标基因测序技术检测中国广西壮族儿童原发性肾病综合征TRPC6基因致病突变的方法，该方法快速而有效，可以使我们对壮族儿童原发性肾病综合征分子病因学有更好的认识。

利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，具体是通过利用目标基因测序技术检测中国广西壮族儿童原发性肾病综合征TRPC6基因致病突变的方法，包括如下步骤：