[发明专利]一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法

说明书

本发明公开了一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，属于化学检测及药物分析技术领域，包括如下步骤：(1)使用透明质酸酶对透明质酸凝胶进行酶降解处理；(2)取等量经步骤(1)酶降解获得的样品，分为降解组和总糖组，降解组加入分离剂，总糖组加入与所述分离剂等量的水，两组各自混合均匀后离心，取上清，用水稀释后待检测；(3)通过咔唑显色反应测定步骤(2)降解组和总糖组待检测样品葡萄糖醛酸的吸光度值，降解组吸光度值与总糖组吸光度值的比值即为透明质酸凝胶的体外降解率。本发明方法操作简单、快速、成本低，适用于交联透明质酸凝胶和未交联透明质酸凝胶的体外降解率测定。

技术领域

本发明属于化学检测及药物分析技术领域，具体涉及一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法。

背景技术

透明质酸由(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接组成，是一种链状聚阴离子黏多糖；透明质酸及其盐是人和动物皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，参与多种细胞活动和组织过程。基于透明质酸良好的生物相容性，其已被广泛应用于食品、日化和医药领域；而高纯度的医用级透明质酸已被制成注射剂，用于眼科、骨科、预防术后粘连、治疗骨性关节炎、类风湿性关节炎以及美容填充。

将透明质酸及其盐应用于上述领域时，通常需要进行透明质酸凝胶的体外降解试验研究，高效液相色谱法(HPLC)和水相凝胶渗透色谱(GPC)是较为常见的检测方法，然而其操作繁琐、设备成本高，不适于推广应用。

因此，亟待提供一种简便、快速、成本低的测定透明质酸凝胶体外酶降解的方法。

发明内容

本发明公开了一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，其操作简单、快速、成本低，适用于交联透明质酸凝胶和未交联透明质酸凝胶的体外降解率测定。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，包括如下步骤：

(1)使用透明质酸酶对透明质酸凝胶进行酶降解处理；

(2)取等量经步骤(1)酶降解获得的样品，分为降解组和总糖组，降解组加入分离剂，总糖组加入与所述分离剂等量的水，两组各自混合均匀后离心，取上清，用水稀释后待检测；

(3)通过咔唑显色反应测定步骤(2)降解组和总糖组待检测样品中葡萄糖醛酸的吸光度值，降解组吸光度值与总糖组吸光度值的比值即为透明质酸凝胶的体外降解率。

本发明中透明质酸凝胶经过透明质酸酶处理，糖苷键断裂，逐渐降解为单糖；降解组通过添加分离剂可使未降解的透明质酸凝胶沉出，离心取上清液，得到已降解的单糖，通过咔唑显色反应，测得已降解葡萄糖醛酸对应的吸光度值(Abs1)；而总糖组测得是总的葡萄糖醛酸所对应的吸光度值(Abs)，进而根据Abs1/Abs即计算得到凝胶降解率。

本发明采用分离剂对降解和未降解透明质酸凝胶进行有效分离，通过葡萄糖醛酸的吸光度值即可计算体外降解率，无需将吸光度转化为具体的葡萄糖醛酸含量，计算简便，结果准确；酶降解后无需进行酶的灭活，酶的存在对于测定并无影响；且该方法对交联透明质酸凝胶和未交联透明质酸凝胶的体外降解均适用，不会因样品为双相体系造成干扰。

优选地，步骤(1)中，透明质酸酶配置成浓度为2-15U/mL的溶液进行酶降解处理。

进一步优选地，透明质酸酶溶液溶度为5-10U/mL。

优选地，步骤(1)中，取透明质酸凝胶，加入磷酸盐缓冲液和透明质酸酶溶液，37℃恒温振荡酶降解；

磷酸盐缓冲液用量为2-5mL/0.1-0.5g透明质酸凝胶；

透明质酸酶溶液用量为1-5mL/0.1-0.5g透明质酸凝胶；

酶降解时间为2-8h。