[发明专利]一种以叶片为外植体的瑶山苣苔组织培养方法

说明书

本发明公开了一种以叶片为外植体的瑶山苣苔组织培养方法。本发明以人工消毒处理获得的瑶山苣苔细嫩叶片为外植体进行组织培养，取材方便，由于采用独特的培养基和培养方法，具有成功率高、繁殖效率高、种苗品质好等特点。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种以叶片为外植体的瑶山苣苔组织培养方法。

背景技术

瑶山苣苔(Dayaoshania cotinifolia)是苦苣苔科瑶山苣苔属多年生常绿草本,于1992年就被列为国家一级保护濒危植物，2012年被列为国家极小种群野生植物。其濒危的主要原因是分布区极其狭小、自然条件下难以结实、种子萌发率较低等内在原因和生境遭到破坏等外在因素。对瑶山苣苔进行种质资源保护和观赏应用均需要大量的种苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种以叶片为外植体的瑶山苣苔组织培养方法。本发明以经过杀菌培养的瑶山苣苔细嫩叶片为外植体，利用组织培养技术能进行瑶山苣苔种苗的规模化繁殖。

本发明的以叶片为外植体的瑶山苣苔组织培养方法，包括以下步骤：

a.洗净瑶山苣苔根部的泥土，用25％多菌灵可湿性粉剂500-800倍液浸泡20-40分钟，栽植于灭菌的的混合基质中，然后用25％多菌灵可湿性粉剂500-800倍液浇透混合基质；

b.培养7天后用72％农用链霉素可溶性粉剂3000-4000倍液浇灌基质一次并喷施叶片，再过7天后用25％多菌灵可湿性粉剂500-800倍液浇透基质并喷施叶片；然后再重复步骤b的前述操作2次，培养至长出细嫩叶片；

c.切取长度1.5-2.5厘米的细嫩叶片，在体积分数75％乙醇水溶液中浸泡10-30秒后，用1.0％有效氯的次氯酸溶液浸泡5-10分钟，无菌水冲洗4-5次，再用0.1％升汞溶液消毒5-10分钟，无菌水冲洗4-5次，切取带叶柄的叶片接种到不定芽诱导培养基，培养获得不定芽；

所述的不定芽诱导培养基，每升由以下成分组成：0.5-1.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)、0.5-1.0mg激动素(KT)、0.1-0.3mg噻苯隆(TDZ)、20-30g蔗糖、6g琼脂，余量为MS培养基，pH5.8-6.0；

d.取不定芽接种在初代增殖培养基上，培养形成丛生芽；将丛生芽接种到丛生芽继代增殖培养基上进行丛生芽的继代增殖；

所述的初代增殖培养基，每升由以下成分组成：0.5-1.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)、0.5-1.0mg激动素(KT)、0.5-1.0mg噻苯隆(TDZ)、20-30g蔗糖、6g琼脂，余量为MS培养基，pH5.8-6.0；

所述的丛生芽继代增殖培养基，每升由以下成分组成：0.5-1.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)、0.5-1.0mg激动素(KT)、0.5-1.0mg萘乙酸(NAA)、20-30g蔗糖、6g琼脂，余量为MS培养基，pH 5.8-6.0；

e.切下继代增殖的2-3厘米高的丛生芽切成单芽接种到生根培养基培养生根苗；

所述的生根培养基，每升由以下成分组成：0.5-1.0mg吲哚丁酸(IBA)、0.5-1.0mg萘乙酸(NAA)、20-30g蔗糖、6g琼脂，余量为1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；

f.待生根苗长至4-5厘米高时，炼苗，移栽。

所述的步骤a的混合基质为将泥炭土、蛭石、珍珠岩以体积比1-3:1-3:1混合得到的。

所述的步骤b-e的培养条件为温度24℃-28℃，光照强度1500-2000lx，光照12-16小时/天。

所述的步骤f的移栽，基质为将泥炭土、蛭石、珍珠岩以体积比1-3:1-3:1混合得到的栽培基质。