[发明专利]一种特异性结合盐酸沙拉沙星核酸适配体的筛选方法

权利要求书

1.一种特异性结合盐酸沙拉沙星核酸适配体的筛选方法，其特征在于：

1).合成以下序列所示的原始随机ssDNA文库和引物：

原始随机ssDNA文库具体如下：

5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-N40-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’；

上游引物：5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’

下游引物1：5’-ACCACGACGACACACCCTAA-3’

下游引物2：5’-bio-ACCACGACGACACACCCTAA-3’

2).SELEX技术筛选特异性核酸适配体

2.1配制实验过程所需溶液

(1)100mL筛选液Selection Buffer配置方法：0.037g KCl，0.011g CaCl₂，0.5844gNaCl，0.019g MgCl₂，0.24g Tris，20μL Tween 20，调pH到7.6，用去离子水补至100mL；

(2)100mL清洗液Washing Buffer配置方法：21g尿素，0.48g Tris，0.37g EDTA﹒Na₂，20μL Tween 20，调pH到8.0，用去离子水补至100mL；

(3)100mL结合洗脱液Binding and Washing(BW)Buffer配置方法：0.12g Tris，0.037gEDTA﹒Na₂，11.68g NaCl，调pH到7.4，用去离子水补至100mL；

(4)100mL氨基磁珠偶联缓冲液配置方法：1.95g 2-吗啉乙磺酸，调pH到4.0，用去离子水补至100mL；

(5)100mL氨基磁珠封闭缓冲液配置方法：2.4g Tris，调pH到8.0，用去离子水补至100mL；

(6)100mL链霉亲和素磁珠的结合缓冲液配置方法：5.84g NaCl，0.24g Tris，0.037gEDTA﹒Na₂，20μL Tween 20，调pH到7.8，用去离子水补至100mL；

2.2氨基磁珠偶联盐酸沙拉沙星

(1)使用前将氨基磁珠在磁力分离机上振荡20秒，混合均匀；用移液枪吸取50μL磁珠加入1.5mL离心管中，用200μL氨基磁珠偶联缓冲液洗涤磁珠2次，用磁铁沉降磁珠，用移液枪吸弃上清液；

(2)向清洗好的氨基磁珠中加入60μL 2mg/mL的盐酸沙拉沙星溶液；同时用冷的去离子水配置50mg/mL的EDC-HCL(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，取30μL EDC-HCL溶液加入上述体系，并涡旋，在30℃摇床中120转震荡孵育2小时；

(3)在离心管中加入200μL的氨基磁珠封闭缓冲液重悬磁珠，在30℃摇床中120转震荡孵育30分钟；孵育结束后用磁铁沉降磁珠，用移液枪吸弃上清液；

(4)加入200μL的磷酸缓冲盐溶液重复洗涤磁珠2次，用磁铁沉降磁珠，用移液枪吸弃上清液；最后在磁珠中加入100μL磷酸缓冲盐溶液重悬磁珠，4℃保存以备后续实验使用；

2.3SELEX体外筛选

(1)取10μL 10μM的ssDNA文库加入到离心管中，95℃变性5分钟，然后立即冰水浴10分钟，加入100μL的Selection Buffer到离心管中混合均匀，25℃下孵育20分钟，备用；

(2)取偶联盐酸沙拉沙星的磁珠100μL，用400μL的Selection Buffer清洗3次，吸弃上清，然后加入步骤(1)中与Selection Buffer混合均匀的ssDNA文库于25℃的摇床中120转震荡孵育1小时；

(3)孵育结束后，磁分离用磁铁沉降磁珠，再用移液枪弃掉未与盐酸沙拉沙星-磁珠结合的ssDNA，磁珠用200μL的Washing Buffer清洗3次；

(4)清洗完毕后用磁铁沉降磁珠，在磁珠中加入50μL Binding and Washing Buffer，混合均匀，95℃水浴5分钟；然后用磁铁沉降磁珠，吸取上清液备用；

2.4PCR扩增

以上清液为模板，下游引物2和上游引物进行PCR扩增；PCR反应体系：

PCR反应条件：1、94℃预变性1min；2、94℃变性30s；3、60℃退火30s4、72℃延伸1min；5、72℃延伸2min；6、4℃恒温保存；其中2-4歩设置循环，循环次数为30次；

2.5次级ssDNA文库的制备

(1)取70μL的链霉亲和素磁珠，用200μL的Washing Buffer清洗3次，用磁铁沉降磁珠，用移液枪吸弃上清，加入100μL链霉亲和素结合缓冲液混匀磁珠，取PCR产物加入到链霉亲和素磁珠中，在30℃摇床中120转振动摇匀孵育30分钟，磁分离用磁铁沉降磁珠，再用移液枪吸弃上清液，用200μL的Washing Buffer清洗磁珠3次，磁分离用磁铁沉降磁珠，再用移液枪吸弃上清液；

(2)向偶联生物素的PCR产物的链霉亲和素磁珠中加入50μL 0.2mol/L的氢氧化钠溶液，在37℃120转摇床中反应15分钟，磁分离用磁铁沉降磁珠用移液枪吸取上清液到离心管中，在离心管中加入2mol/L的稀盐酸用广泛pH试纸调至7.0；该次级ssDNA文库用作下一轮筛选；

2.6检测

(1)得到的次级文库分为三份，一份保存，一份用于Q-PCR检测，一份用于下一轮筛选；

(2)以次级文库为模板，下游引物1和上游引物进行Q-PCR检测，分析熔解曲线以判断扩增的特异性；Q-PCR体系包括：模板2μL，SYRB Mixture 10μL，上游引物0.2μL，下游引物10.2μL，ddH₂O 7μL；

Q-PCR程序包括：95℃预变性30s，并进行30个循环的95℃变性30s、54℃退火30s、70℃延伸15s，最后添加熔解曲线程序；

(3)Q-PCR测得到的Ct值应逐轮降低；荧光阀值设置为100，样品的Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，模板的量越大，Ct值越小；根据扩增曲线计算Ct值，筛选的次级文库的Ct值不再降低则停止筛选。