[发明专利]一种特异性结合盐酸沙拉沙星核酸适配体的筛选方法

说明书

一种特异性结合盐酸沙拉沙星核酸适配体的筛选方法涉及化学分析技术领域。本发明提供一种具有比蛋白抗体更高亲和特异性、无免疫原性、能够化学合成的、分子量小且性质稳定的可用于盐酸沙拉沙星检测的核酸适配体。本发明采用SELEX技术，以盐酸沙拉沙星为靶物，筛选出与盐酸沙拉沙星特异性结合的核酸适配体。

技术领域

本发明涉及化学分析技术领域，具体地说是一种特异性结合盐酸沙拉沙星核酸适配体的筛选方法。

背景技术

核酸适配体(又称适配体，aptamer)是通过指数富集的配体系统进化(systematicevolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选得到的能够与靶分子特异性结合的人工合成的ssDNA或RNA片段。适体具有靶分子广泛、亲和力强、易修饰等优点，在分子化学、食品安全、临床诊断与治疗等方面应用广泛。

SELEX是利用组合化学的原理，在体外构建一个人工合成的随机寡核苷酸文库，经过文库中序列与靶标的特异性结合，筛选目标核酸适配体的一种新技术。由于随机文库中含有大量一级结构不同的单链寡核苷酸片段，他们在溶液中与靶分子相遇时，可以形成不同的空间结构，由于其空间结构的多样性，可供靶分子通过构象匹配的方式筛选出能与其具有高亲和力和特异性的核酸序列。

沙拉沙星是一种非常高效的抗菌剂，然而，它可能是牛奶和动物源食品中的一种残留物。这些残留物可能引起人体健康问题，影响呼吸道、泌尿道、胃肠道和皮肤，也可能促进耐抗生素病原体的发展。由于沙拉沙星的毒性，家禽和鱼类大量使用沙拉沙星会导致抗生素残留，给人们的食品安全带来极其严重的后果。家禽和鱼类大量使用沙拉沙星会导致抗生素残留，给人们的食品安全带来极其严重的后果。美国、欧盟等一些国家都已经制订了相应的残留标准，欧盟(EU)将沙拉沙星在鸡肉中的最大残留限量(MRL)规定为10μg/kg，我国在农业部规定动物源食品中沙拉沙星的最高含量不得超过80μg/kg。本实验通过基于磁分离的SELEX技术(Mag-SELEX)得到了两条能够与盐酸沙拉沙星特异性结合的ssDNA核酸适配体。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高亲和特异性、无免疫原性、能够化学合成的、分子量小且性质稳定的可用于盐酸沙拉沙星检测的核酸适配体。本发明采用SELEX技术，以盐酸沙拉沙星为靶物，筛选出与盐酸沙拉沙星特异性结合的核酸适配体。

上述目的通过以下技术方案实现：

1.合成以下序列所示的原始随机ssDNA(单链DNA)文库和引物：

原始随机ssDNA文库：

5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-N40-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’；

上游引物：5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’

下游引物1：5’-ACCACGACGACACACCCTAA-3’

下游引物2：5’-bio-ACCACGACGACACACCCTAA-3’

2.SELEX技术筛选特异性核酸适配体

2.1实验过程所需溶液

(1)100mL筛选液Selection Buffer配置方法：0.037g KCl，0.011g CaCl₂，0.5844g NaCl，0.019g MgCl₂，0.24g Tris，20μL Tween 20，调pH到7.6，用去离子水补至100mL；

(2)100mL清洗液Washing Buffer配置方法：21g尿素，0.48g Tris，0.37g EDTA﹒Na₂，20μL Tween 20，调pH到8.0，用去离子水补至100mL；