[发明专利]一种个体化肿瘤新抗原介导抗肿瘤细胞免疫应答的体外预测方法及应用

权利要求书

1.一种个体化肿瘤新抗原介导抗肿瘤细胞免疫应答的体外预测方法，其特征在于，步骤包括：

A、肿瘤原代细胞培养；

B、可冻存的肿瘤抗原负载的DC细胞的获得；

C、肿瘤新抗原特异性T细胞获得；

D、新抗原特异性T细胞功能检测。

2.根据权利要求1所述个体化肿瘤新抗原介导抗肿瘤细胞免疫应答的体外预测方法，其特征在于，所述肿瘤原代细胞培养步骤包括：

A1.在1-2 h内取下肿瘤块并用生理盐水或者PBS清洗，然后物理剪切成小块并置于高糖DMEM细胞培养基中；

A2.将组织块转移到加有HBSS的50 mL离心管中轻摇混匀后 400g ，5-10 min低温离心，弃上清并重新添加HBSS，重复次3次；

A3.转移到含有高糖DMEM培养基的10cm 无菌培养皿中并进一步剪切到直径3-5mm；

A4.将得到的细胞悬液以及组织块用100um 细胞滤网过滤到50mL 离心管中 162g离心4min；

A5.弃上清，并添加5-20 mL DMEM培养基重悬细胞；

A6.用排枪将重悬好的细胞转移到96孔细胞培养板中150uL/孔培养7天，然后转移到低附着性培养瓶中继续培养，每4天换一次液，直到细胞群体积开始变大，之后每7天换一次液，21天之后原代培养基中不加入ROCK 抑制剂；

A7.当细胞密度长到100个细胞群/mL 时,冻存到含有10% DMSO液氮中。

3.根据权利要求1所述个体化肿瘤新抗原介导抗肿瘤细胞免疫应答的体外预测方法，其特征在于，步骤A3中，所述DMEM培养基含有10%的血清。

4.根据权利要求1所述个体化肿瘤新抗原介导抗肿瘤细胞免疫应答的体外预测方法，其特征在于，所述DC细胞的获得步骤为：患者注射肿瘤新抗原疫苗后采血50mL，用传统密度梯度离心法获外周血单个核细胞，利用磁珠分离并诱导成抗原负载的成熟DC细胞，收集DC细胞并冻存在液氮。

5.根据权利要求1所述个体化肿瘤新抗原介导抗肿瘤细胞免疫应答的体外预测方法，其特征在于，所述肿瘤新抗原特异性T细胞获得步骤包括：

C1.患者注射肿瘤新抗原疫苗后采血50mL，密度梯度离心法获外周血单个核细胞3-5×10⁸，用抗人CD14抗体磁珠获得纯度大于90% 的CD14 阳性单个核细胞，CD14阴性淋巴细胞冻存；

C2.单个核细胞2×10⁶培养在内含1000U/mL 粒细胞巨噬细胞集落生子因子、1000U/mL重组人白介素4的无血清GMP CellGro培养基；

C3.第3天加入10 mmol/mL肿瘤新抗原多肽，过夜；

C4.第4天加入2.5ug/mL人工合成的单磷酰脂质A和1000 U/mL医药级别的伽玛干扰素继续培养24 h；

C5.第5天收集抗原负载的DC细胞，一半冻存；

C6.将C1步骤冻存的CD14阴性淋巴细胞复苏与DC细胞以10:1的比例在含有10%自体血清的X-VIVO20培养液培养14天，在第3天和第10天加入20 ng/mL人重组白介素2；

C7.DC与T细胞共培养的第7天，加入复苏冻存的抗原负载的DC共培养；

C8.第14天，加入50 ng/mL 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯、1 mg/mL 离子霉素和10mg/mL 布雷菲德菌素A培育5 h后，收获抗原特异性CD8细胞。

6.根据权利要求1所述个体化肿瘤新抗原介导抗肿瘤细胞免疫应答的体外预测方法，其特征在于，所述新抗原特异性T细胞功能检测步骤包括：

D1.向检测板中加入培养基并测定背景阻抗值；

D2.收集对数期细胞并计数，调整细胞悬液浓度，向检测板中加入一定体积的细胞，室温超净台内放置30min；

D3.将加入细胞的检测板放入检测台上，进行实时动态的细胞增殖检测；

D4.过夜检测后，向各培养孔中加入配制好的细胞因子并继续进行实时动态检测，即可获得细胞因子介导的细胞效应曲线及不同时间段IC50值。

7.根据权利要求1-6任一项所述预测方法在生产特异性抗肿瘤疫苗中的应用。