[发明专利]一种个体化肿瘤新抗原介导抗肿瘤细胞免疫应答的体外预测方法及应用

说明书

本发明是一种个体化肿瘤新抗原介导抗肿瘤细胞免疫应答的体外预测方法，步骤包括，A、肿瘤原代细胞培养；B、可冻存的肿瘤抗原负载的DC细胞的获得；C、肿瘤新抗原特异性T细胞获得；D、新抗原特异性T细胞功能检测。本方法与传统相比，具有创新性，能够在短时间内分析鉴定数百个突变多肽序列，筛选出能产生特异性抗肿瘤免疫应答的突变多肽制备疫苗，提高疗效。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种个体化肿瘤新抗原介导细胞免疫应答的体外预测方法及应用。

背景技术

癌细胞突变基因编码的氨基酸序列称为 “新抗原”（neoantigen)，主要由点突变、缺失突变、融合突变等产生的、正常细胞没有的、新的异常蛋白/多肽。新生抗原用作疫苗，经DC细胞摄取、改造和提呈，产生具识别肿瘤新抗原的特异性T淋巴细胞，发挥抗肿瘤细胞免疫应答。然而，很多研究结果显示，虽然依靠遗传信息推算得出的肿瘤新生抗原数量很多，但能被自体T细胞识别的却只有大约1-2%，即使是浸润在肿瘤内的T细胞也只能识别1/11的新抗原。因此，如何鉴定突变多肽的免疫原性，是确保新抗原多肽疫苗疗效的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种个体化肿瘤新抗原介导的细胞免疫应答的体外预测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种个体化肿瘤新抗原介导抗肿瘤细胞免疫应答的体外预测方法，步骤包括：

A、肿瘤原代细胞培养；

B、可冻存的肿瘤抗原负载的DC细胞的获得；

C、肿瘤新抗原特异性T细胞获得；

D、新抗原特异性T细胞功能检测。

进一步的，所述肿瘤原代细胞培养步骤包括：

A1.在1-2 h内取下肿瘤块并用生理盐水或者PBS清洗，然后物理剪切成小块并置于高糖DMEM细胞培养基中；

A2.将组织块转移到加有HBSS的50 mL离心管中轻摇混匀后 400g ，5-10 min低温离心，弃上清并重新添加HBSS，重复次3次；

A3.转移到含有高糖DMEM培养基的10cm 无菌培养皿中并进一步剪切到直径3-5mm；

A4.将得到的细胞悬液以及组织块用100um 细胞滤网过滤到50mL 离心管中 162g离心4min；

A5.弃上清，并添加5-20 mL DMEM培养基重悬细胞；

A6.用排枪将重悬好的细胞转移到96孔细胞培养板中150uL/孔培养7天，然后转移到低附着性培养瓶中继续培养，每4天换一次液，直到细胞群体积开始变大，之后每7天换一次液，21天之后原代培养基中可以不加入ROCK 抑制剂；

A7.当细胞密度长到100个细胞群/mL 时,冻存到含有10% DMSO液氮中。

进一步的，步骤A3中，所述DMEM培养基含有10%的血清。

进一步的，所述DC细胞的获得步骤为：患者注射肿瘤新抗原疫苗后采血50mL，用传统密度梯度离心法获外周血单个核细胞，利用磁珠分离并诱导成抗原负载的成熟DC细胞，收集DC细胞并冻存在液氮。

进一步的，所述肿瘤新抗原特异性T细胞获得步骤包括：

C1.患者注射肿瘤新抗原疫苗后采血50mL，密度梯度离心法获外周血单个核细胞3-5×10⁸，用抗人CD14抗体磁珠获得纯度大于90% 的CD14 阳性单个核细胞，CD14阴性淋巴细胞冻存；

C2.单个核细胞2×10⁶培养在内含1000U/mL 粒细胞巨噬细胞集落生子因子、1000U/mL重组人白介素4的无血清GMP CellGro培养基；

C3.第3天加入10 mmol/mL肿瘤新抗原多肽，过夜；

C4.第4天加入2.5ug/mL人工合成的单磷酰脂质A和1000 U/mL医药级别的伽玛干扰素继续培养24 h；