[发明专利]一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法

权利要求书

1.一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法，其特征在于，

其包括以下步骤：

S1:取全血，进行离心，弃上清，得到红细胞；

S2：将步骤S1制备的红细胞用PBS液进行洗涤后，进行离心后，弃上清；

S3：将S2弃上清后的悬浮液加入PBS后进行重悬，然后将等量分装在若干个EP管内；

S4：将EP管内的液体离心后，弃上清；

S5：向EP管内加入不同pH值的标定液和样品缓冲液，进行孵育，配制出不同pH值的红细胞标定液样品；

S6：将S5样品采用流式细胞仪收集荧光信号；

S7：根据S6收集的荧光信号，绘制出平均荧光强度与pH的标准曲线，得到线性方程；

S8：按照S1-S4步骤制备将待测红细胞样品，将待测红细胞样品采用流式细胞仪收集的平均荧光强度代入S7方程内计算即可得到待测红细胞内pH值。

2.根据权利要求1所述的一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

S1:取全血，1500rpm离心5min后，弃上清后，得到红细胞；

S2：将步骤S1制备的红细胞用PBS液进行洗涤后，1500rpm离心5min后，弃上清；

S3：将S2弃上清后的悬浮液加入PBS后进行重悬，然后将等量分装在若干个EP管内；

S4：将EP管内的液体离心10min后，弃上清；

S5：向EP管内加入不同pH值的标定液和样品缓冲液，在37℃条件下孵育15min，配制出不同pH值的红细胞标定液样品；；

S6：将S5样品采用流式细胞仪收集荧光信号；

S7：根据S6收集的荧光信号，绘制出平均荧光强度与pH的标准曲线，得到线性方程；

S8：按照S1-S4步骤制备将待测红细胞样品，将待测红细胞样品采用流式细胞仪收集的平均荧光强度代入S7方程内计算即可得到待测红细胞内pH值。

3.根据权利要求1或2所述的一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法，其特征在于，所述标定液的配制为：

母液：120mM KCl、30mM NaCl、1mM CaCl₂、0.5mM MgSO₄、1mM NaH₂PO₄、5mM葡萄糖、20mMHEPES、HCl或NaOH；其中HCl或NaOH用来调节梯度pH(6.9-7.6)；

调节液为尼日利亚菌素，其与母液的使用体积配比为1:200，其中尼日利亚菌素为溶于无水乙醇的2mM溶液，其为现配现用。

4.根据权利要求1或2所述的一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法，其特征在于，步骤S6中流式细胞仪采用488nm激发，BL3通道(PerCP-Cy5.5)收集荧光信号。