[发明专利]一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法

说明书

本发明公开了一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法，其通过配制不同pH值标定液，收集标定液的荧光强度信号，绘制出平均荧光强度与pH的标准曲线，得到线性方程，通过将待测红细胞样品中的平均荧光强度代入标准曲线，即可得到待测红细胞内pH值。本发明的方法用于检测红细胞内的pH值具有操作简单、耗时短、检测结果稳定等优点。本发明的利用红细胞自发荧光特性，不需另加或配制荧光染料，建立不同pH环境下与红细胞荧光强度变化的标准曲线，反过来计算出不同荧光强度红细胞内对应的pH值。此方法的pH的精度值能够达到0.01个pH单位，精度高。

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法。

背景技术

体液占人体的60％-70％，其中2/3位于细胞内。酸碱度(pH)尤其是细胞内液酸碱度在各种细胞生物学行为中发挥重要调控作用，例如酶活性、细胞增殖与凋亡、信息传递和肿瘤细胞抗药性等，是影响细胞功能的重要微环境指标。

然而，目前临床上的血气分析技术测的是血清中的酸碱度，相当于细胞外液的酸碱度，而对占体液绝大多数的细胞內液的酸碱变化以及细胞内、外液酸碱平衡之间的关系，研究甚少。然而，近年来，人们越来越意识到细胞内环境稳定的重要性，尤其是主要生理功能为携带氧气和二氧化碳，并将其输送到人体的各个组织和器官的红细胞，红细胞内的环境(尤其酸碱)的变化对胞内血红蛋白的结构和功能有着重要的影响，因此对红细胞内影响环境变化的pH值检测与监控尤为重要。而现有的普通细胞内pH检测的手段主要是采用孵育pH敏感的比率型纳米探针，但是红细胞具有自荧光效应，其应用于红细胞胞内pH检测时易受影响，检测误差大。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，耗时短，测量结果稳定的利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法。

本发明的技术方案为：

一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法，其包括以下步骤：

S1:取全血，进行离心，弃上清，得到红细胞；

S2：将步骤S1制备的红细胞用PBS液进行洗涤后，进行离心后，弃上清；

S3：将S2弃上清后的悬浮液加入PBS后进行重悬，然后将等量分装在若干个EP管内；

S4：将EP管内的液体离心后，弃上清；

S5：向EP管内加入不同pH值的标定液和样品缓冲液，进行孵育，配制出不同pH值的红细胞标定液样品；

S6：将S5样品采用流式细胞仪收集荧光信号；

S7：根据S6收集的荧光信号，绘制出平均荧光强度与pH的标准曲线，得到线性方程；

S8：按照S1-S4步骤制备将待测红细胞样品，将待测红细胞样品采用流式细胞仪收集的平均荧光强度代入S7方程内计算即可得到待测红细胞内pH值。

进一步地，其包括以下步骤：

S1:取全血，1500rpm离心5min后，弃上清后，得到红细胞；

S2：将步骤S1制备的红细胞用PBS液进行洗涤后，1500rpm离心5min后，弃上清；

S3：将S2弃上清后的悬浮液加入PBS后进行重悬，然后将等量分装在若干个EP管内；

S4：将EP管内的液体离心10min后，弃上清；

S5：向EP管内加入不同pH值的标定液和样品缓冲液，在37℃条件下孵育15min，配制出不同pH值的红细胞标定液样品；

S6：将S5样品采用流式细胞仪收集荧光信号；