[发明专利]一种简便、高效的细菌转化方法

说明书

本发明公开了一种简便、高效的细菌转化方法，其主要内容包括：取25μl感受态细胞，加入1μl连接产物，混匀后插在冻存盒中静置。41.5℃热激90s后静置3min，加300μl SOC培养液，37℃、250rpm振荡培养1h，取150μl菌液加到固体培养基上涂布，倒置培养过夜，观察平板上长出的菌落并计数。本发明操作简单、快速，重复性好且转化效率高，菌株适用范围广，一般可获得1×108cfu/μg DNA转化效率。不仅能满足常规的分子生物学实验要求，也能满足基因文库构建等复杂实验的要求。和已有技术相比，本发明成本低廉，不需要冰上操作，没有设备要求的限制，普通摇床即可满足试验需要，可用于一般实验室，也可用于商业化生产，是一项较为实用的新技术，其技术进步是显著的，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学与基因工程技术领域，具体涉及一种简便、高效的细菌转化方法。

背景技术

将外源DNA导入受体细胞，使之获得新的遗传性状的过程称为转化。重组DNA分子能否转化，一方面取决于供体菌与受体菌的亲缘关系，另一方面还与受体菌的生理有关。转化效率是评价感受态细胞优劣的标准之一。

1972年Cohen发明的CaCl₂方法简便易行，但转化效率较低，只用于常规分子生物学实验，不能满足DNA文库构建和大片段DNA的转化；RbCl/KCl法制备的超级感受态细胞转化效率高，但需要特殊的试剂RbCl，限制了该方法的推广；Hanahan法对实验人员的操作技巧和试剂要求高，但重复性不高；1990年Inoue H.等提出的Inoue法的转化效率较高，但对细菌OD600值要求高，而且培养温度要控制在18℃，培养时间长达20-50h，操作过程相对繁琐；也有实验室使用改良的TFB或者FB法，就是添加很多微量离子来提高转化率，但缓冲液配制繁琐，而且成本高，难以被广泛采纳；电击转化法依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率高。但电穿孔法需要特殊的仪器设备电转仪，一般实验室不具备开展电转实验的条件。因此开发一种操作简单、要求低、转化效率高的通用细菌转化方法具有重要的实践意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种简便、高效的细菌转化方法，该方法不仅转化效率高，而且成本低，易于操作，稳定性好，能普遍推广使用，对分子克隆实验具有重要的指导意义。

为了实现以上发明目的，本发明的技术方案如下：

一种简便、高效的细菌转化方法，包括以下步骤：

（1）从-80℃超低温冰箱取出一管感受态细胞，取25μl置于1.5ml EP管中；

（2）将上述管立即放在预冷的冻存盒中静置5-10min；

（3）取1μl连接产物，迅速加入上述管中，轻轻混匀后插在冻存盒中静置20min；

（4）将上述管在41.5℃热激90s后快速放回冻存盒上静置3min；

（5）向上述管中加300μl SOC培养液，37℃，250rpm振荡培养1h，使细菌复苏；

（6）从上述管中取150μl菌液加到含氨苄的2YT固体培养基的抗性平板上均匀涂布；

（7）倒置平皿，放在培养箱内，37℃培养过夜；

（8）观察平板上长出的菌落，以菌落能互相分开为宜；

（9）计数菌落，计算转化效率。

优选的，所述步骤1) 仅需25μl感受态细胞，用量少，大大节省了成本；

优选的，所述步骤2) 仅需预冷的冻存盒，无须冰上操作，大大简化了工作流程；

优选的，所述步骤3) 仅需1μl连接产物，用量少，节省了样本；

优选的，所述步骤3) 混匀后放在冻存盒中静置20min，无须冰上操作，大大简化了工作流程；

优选的，所述步骤4) 将上述管放在41.5℃热激90s，降低热激温度，起到保护作用；